마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석
Summary
여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.
Abstract
단 세포 mRNA 염기서열 분석은 지난 몇 년 동안 중요한 진전을 이루었으며 발달 생물학 분야에서 중요한 도구가 되었습니다. 그것은 성공적으로 희귀 한 세포 집단을 식별 하는 데 사용 되었습니다., 새로운 마커 유전자를 발견, 공간 및 시간 개발 정보를 디코딩. 단일 셀 방법은 또한 지난 2 ~ 3 년 동안 미세 유체 기반 Fluidigm C1 기술에서 액적 기반 솔루션으로 진화했습니다. 여기에서 우리는 액적 기반 scRNA-Seq 방법을 사용하여 마우스 배아 조직 세포를 프로파일업하는 방법을 입증하기 위해 예를 들어 심장을 사용했다. 또한 워크플로우에 두 가지 전략을 통합하여 단일 실험에서 여러 샘플을 프로파일로 프로파일합니다. 통합된 방법 중 하나를 사용하여 8개의 심장 샘플에서 9,000개 이상의 세포를 동시에 프로파일화했습니다. 이 방법은 다른 유전 적 배경, 발달 단계 또는 해부학 적 위치에서 단일 세포를 동시에 프로파일러딩하는 비용 효율적인 방법을 제공함으로써 발달 생물학 분야에 가치가있을 것입니다.
Introduction
각 단하나 세포의 전사 단면도는 배아 발달 도중 세포 인구 사이에서 변화합니다. 단일 분자가 소수의 유전자1의발현을 시각화하는데 사용될 수 있지만, 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq)은 단일 세포에서 유전자의 게놈 전체 발현 패턴을 예시하는 편견없는 접근법을 제공한다. 2009년에 처음 발표된 후2,scRNA-Seq는 최근 몇 년 동안다발성발달 단계에서 다중 조직을 연구하기 위해3,4,5. 또한, 인간 세포 아틀라스가 최근 발달 중심 프로젝트를 시작함에 따라 인간 배아 조직에서 더 많은 단일 세포 데이터가 가까운 장래에 생성 될 것으로 예상됩니다.
개발하는 첫번째 기관으로 심혼은 배아 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 심혼은 다중 세포 모형으로 이루어져 있고 각 세포 모형의 발달은 단단히 시간적으로 그리고 공간적으로 통제됩니다. 지난 몇 년 동안, 초기 발달 단계에서 심장 세포의 기원과 세포 혈통은 선천성 심장 질환 병인을 이해하는 데 엄청난 유용한 탐색 도구를 제공하는6을특징으로하며, 심근 세포 재생을 자극하는 보다 기술적으로 진보 된 방법을 개발하기위한7.
scRNA-Seq는 최근8,9,10에서급속한 확장을 겪고있다. 새로 개발 된 방법으로, 단일 세포 실험의 설계 및 분석은 더 달성될 11,12,13,14. 여기서 제시된 방법은 액적 용액에 기초한 상업적 절차(재료표참조)15,16. 이 방법은 미세 유체 제어 기제어 시스템의 제어하에 오일-물 에멀젼 액적에 고유한 바코드 비드 세트를 캡처하는 기능을 제공합니다. 액적으로 의한 세포 로딩속도는 매우 낮기 때문에 대부분의 액적 에멀젼은 하나의셀(17)만을함유하고 있다. 절차의 독창적 인 디자인은 이질적인 집단에 RNA-Seq를 사용하여 개별 세포의 병렬 분석을 가능하게하는 바코드와 동시에 발생하는 액적 에멀젼으로 단일 세포 분리에서 비롯됩니다.
멀티플렉싱 전략의 편입은 기존의 단일 셀워크플로우(13,14)에중요한 추가 사항 중 하나이다. 이 추가는 셀 더블을 폐기하고, 실험 비용을 절감하고, 배치 효과18,19를제거하는 데 매우 유용합니다. 지질 기반 바코드 전략 및 항체 기반 바코드 전략(재료 표참조)은 주로 사용되는 두 가지 다중화 방법입니다. 특정 바코드는 두 가지 방법으로 각 샘플에 라벨을 부착하는 데 사용되며, 표지된 샘플은 단일 셀 캡처, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 혼합됩니다. 그 후, 풀링된 시퀀싱 데이터는 바코드 시퀀스를 분석하여 분리될 수있다(도 1)19. 그러나 두 메서드 간에는 상당한 차이가 있습니다. 지질 기반 바코드 전략은 지질 변형 올리고뉴클레오티드를 기반으로 하며, 이는 어떤 세포 유형 선호도가 없는 것으로 밝혀졌다. 항체 기반 바코드 전략은 항원 단백질을 발현하는 세포만을 검출할 수 있는반면,20. 또한, 지질을 염색하는 데 약 10분이 걸리지만 항체를 염색하는 데는 40분이 걸린다(도1). 더욱이, 지질 변형 올리고뉴클레오티드는 항체-컨쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드보다 저렴하지만 이 기사를 쓰는 시점에서 시판되지 않는다. 마지막으로, 지질 기반 전략은 한 실험에서 96개의 샘플을 다중화할 수 있지만, 항체 기반 전략은 현재 12개의 샘플만 멀티플렉스할 수 있다.
단일 실험에서 멀티플렉스에 대한 권장 세포 수는 2.5 x 104보다낮아야 하며, 그렇지 않으면 세포 배더의 높은 비율과 잠재적인 주변 mRNA 오염으로 이어질 것이다. 멀티플렉싱 전략을 통해 단일 세포 캡처, cDNA 생성 및 여러 샘플에 대한 라이브러리 준비 비용은 하나의 샘플 비용으로 감소되지만 시퀀싱 비용은 동일하게 유지됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서, 우리는 단일 세포 전사 프로파일을 분석하는 프로토콜을 입증했다. 우리는 또한 scRNA-Seq 워크플로우에서 멀티플렉스 샘플에 두 가지 선택적 방법을 제공했습니다. 두 방법 모두 다양한 실험실에서 실현 가능한 것으로 입증되었으며 비용 효율적이고 배치 효과가없는 단일 세포 실험18,26을실행하는 솔루션을 제공했습니다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 지질 기반 바코드 시약의 종류 공급과 실험 단계 및 데이터 분석에 대한 제안에 대한 박사 Zev J. Gartner 실험실에서 데이비드 M. 패터슨과 크리스토퍼 S. 맥기니스 에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 설립 되었다 (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
Riferimenti
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