Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos
Summary
Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.
Abstract
O sequenciamento de mRNA de célula única tem feito progressos significativos nos últimos anos e tornou-se uma ferramenta importante no campo da biologia do desenvolvimento. Ele tem sido usado com sucesso para identificar populações de células raras, descobrir novos genes marcador, e decodificar informações espaciais e de desenvolvimento temporal. O método de célula única também evoluiu da tecnologia Fluidigm C1 microfluídica para as soluções baseadas em gotículas nos últimos dois a três anos. Aqui usamos o coração como um exemplo para demonstrar como perfilar as células do tecido embrionário do rato usando o método scRNA-Seq baseado em gotículas. Além disso, integramos duas estratégias no fluxo de trabalho para perfilar várias amostras em um único experimento. Usando um dos métodos integrados, temos simultaneamente perfilado mais de 9.000 células de oito amostras de coração. Estes métodos serão valiosos para o campo da biologia do desenvolvimento, fornecendo uma maneira rentável de perfil simultaneamente células únicas de diferentes origens genéticas, estágios de desenvolvimento ou locais anatômicos.
Introduction
O perfil transcricional de cada célula varia entre as populações celulares durante o desenvolvimento embrionário. Embora a hibridação in situ molecular única possa ser usada para visualizar a expressão de um pequeno número de genes1,o sequenciamento de mRNA de célula única (scRNA-Seq) fornece uma abordagem imparcial para ilustrar padrões de expressão em todo o genoma de genes em células únicas. Depois que foi publicado pela primeira vez em 20092,scRNA-Seq foi aplicado para estudar vários tecidos em vários estágios de desenvolvimento nos últimos anos3,4,5. Além disso, como o atlas de células humanas lançou seus projetos focados no desenvolvimento recentemente, mais dados de células únicas de tecidos embrionários humanos devem ser gerados em um futuro próximo.
O coração como o primeiro órgão a desenvolver desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário. O coração consiste em tipos múltiplos da pilha e o desenvolvimento de cada tipo da pilha é temporal e espacial firmemente regulado. Ao longo dos últimos anos, a origem e linhagem celular de células cardíacas em estágios iniciais de desenvolvimento têm sido caracterizadas6, que fornecem uma tremenda ferramenta de navegação útil para a compreensão da patogênese congênita da doença cardíaca, bem como para o desenvolvimento de métodos tecnologicamente mais avançados para estimular a regeneração cardiomiócito7.
O scRNA-Seq passou por uma rápida expansão nos últimos anos8,9,10. Com os métodos recém-desenvolvidos, o projeto e a análise de experimentos unicelulares tornaram-se mais alcançáveis11,12,13,14. O método apresentado aqui é um procedimento comercial baseado nas soluções de gotículas (ver Tabela de Materiais)15,16. Este método apresenta a captura de células e conjuntos de contas de código de barras únicas em uma gota de emulsão de água de óleo controle de um sistema de controlador microfluídico. A taxa de carregamento celular nas gotículas é extremamente baixa, de modo que a maioria das emulsões de gotículas contenha apenas uma célula17. O projeto engenhoso do procedimento vem da separação da única pilha em emulsões da gotícula que ocorrem simultaneamente com código de barras, que permite a análise paralela de pilhas individuais usando RNA-Seq em uma população heterogeneous.
A incorporação de estratégias multiplexing é uma das adições importantes ao fluxo de trabalho tradicional de célulaúnica13,14. Esta adição é muito útil no descarte de dobradores celulares, reduzindo os custos experimentais e eliminando os efeitos do lote18,19. Uma estratégia de código de barras baseada em lipídios e uma estratégia de código de barras baseada em anticorpos (ver Tabela de Materiais)são os dois métodos multiplexing usados principalmente. Códigos de barras específicos são usados para rotular cada amostra em ambos os métodos, e as amostras rotuladas são então misturadas para captura de célulaúnica, preparação da biblioteca e sequenciamento. Posteriormente, os dados de sequenciamento agrupados podem ser separados analisando as sequências de código de barras(Figura 1)19. No entanto, existem diferenças significativas entre os dois métodos. A estratégia de código de barras baseada em lipídios é baseada em oligonucleotídeos modificados por lipídios, que não foram encontrados para ter qualquer preferência do tipo celular. Enquanto a estratégia de código de barras baseada em anticorpos só pode detectar as células que expressam as proteínas de antígeno19,20. Além disso, leva cerca de 10 min para manchar os lipídios, mas 40 min para manchar os anticorpos (Figura 1). Além disso, os oligonucleotídeos modificados por lipídios são mais baratos do que os oligonucleotídeos conjugados com anticorpos, mas não comercialmente disponíveis no momento da escrita deste artigo. Finalmente, a estratégia baseada em lipídios pode multiplex 96 amostras em um experimento, mas a estratégia baseada em anticorpos atualmente só pode multiplex 12 amostras.
O número de células recomendado para multiplex em um único experimento deve ser inferior a 2,5 x 104, caso contrário, levará a uma alta porcentagem de dobradores celulares e potencial contaminação por mRNA ambiente. Através das estratégias multiplexing, o custo de captura de célulaúnica, geração de cDNA e preparação da biblioteca para várias amostras será reduzido ao custo de uma amostra, mas o custo de sequenciamento permanecerá o mesmo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, demonstramos um protocolo para analisar perfis de transcrição de células únicas. Também fornecemos dois métodos opcionais para amostras multiplex no fluxo de trabalho scRNA-Seq. Ambos os métodos provaram ser viáveis em vários laboratórios e forneceram soluções para executar um experimento de célula única sem efeito de custo e lote18,26.
Há alguns passos que devem ser seguidos cuidadosamente ao passar pelo p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a David M. Patterson e Christopher S. McGinnis do laboratório Dr. Zev J. Gartner por seu suprimento gentil dos reagentes de código de barras baseados em lipídios e sugestões sobre as etapas experimentais e análise de dados. Este trabalho foi fundado pelos Institutos Nacionais de Saúde (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
Riferimenti
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