تقييم التئام الجروح الحادة باستخدام دورسال تحت الجلد بوليفينيل الكحول الإسفنج زرع واستئصال الذيل نماذج الجرح الجلد.
Summary
هنا، يتم وصف نموذجين التئام الجروح المورين، واحد يهدف إلى تقييم الاستجابات التئام الجروح الخلوية والسيتوكين والآخر لتحديد معدل إغلاق الجروح. ويمكن استخدام هذه الأساليب مع نماذج الأمراض المعقدة مثل مرض السكري لتحديد آليات جوانب مختلفة من الشفاء الجروح الفقراء.
Abstract
التئام الجروح هي عملية معقدة تتطلب التقدم المنظم للالتهاب ، وتشكيل أنسجة التحبيب ، والتليف ، والقرار. نماذج المورين توفر قيمة المكنانية البصيرة في هذه العمليات; ومع ذلك، لا يوجد نموذج واحد يعالج تماما جميع جوانب استجابة التئام الجروح. بدلا من ذلك، فمن المثالي لاستخدام نماذج متعددة لمعالجة الجوانب المختلفة للتئام الجروح. هنا، يتم وصف طريقتين مختلفتين التي تعالج جوانب متنوعة من استجابة التئام الجروح. في النموذج الأول ، يتم زرع الإسفنج الكحولي اتّلادي الفينيل تحت الجلد على طول دورسوم الماوس. بعد استرجاع الإسفنج ، يمكن عزل الخلايا عن طريق التعطيل الميكانيكي ، ويمكن استخراج السوائل عن طريق الطرد المركزي ، مما يسمح بتوصيف مفصل للاستجابات الخلوية والسيتوكين في بيئة الجرح الحاد. ومن القيود المفروضة على هذا النموذج عدم القدرة على تقييم معدل إغلاق الجروح. لهذا, يتم استخدام نموذج الختان الجلد الذيل. في هذا النموذج، يتم استئصال قطعة مستطيلة من جلد الذيل مقاس 10 مم × 3 مم على طول السطح الظهري، بالقرب من قاعدة الذيل. يمكن تصوير هذا النموذج بسهولة لتحليل المخطط لتحديد معدلات الشفاء ويمكن استئصاله للتحليل النسيجي. يمكن استخدام كلتا الطريقتين الموصوفتين في سلالات الفئران المعدلة وراثياً، أو بالتزامن مع نماذج من الظروف المرضية، مثل مرض السكري أو الشيخوخة أو العدوى الثانوية، من أجل توضيح آليات التئام الجروح.
Introduction
هناك العديد من أنظمة نموذج المورين المتاحة لفحص عمليات التئام الجروح، كل تمتلك مزايا محددة وقيود1،,2. الأساليب التالية تقدم نموذجين للجرح المورين ، كل منهما يتناول جانبًا معينًا من استجابة التئام الجروح ، والتي يمكن استخدامها لتحديد سبب وتأثير الاضطرابات في الاستجابة للإصابة. تحدث عملية التئام الجروح في مراحل متميزة. المرحلة الأولى هي التهابية ، تتميز بالتدفق السريع للصفائح الدموية ، العدلات ، والخلايا الأحادية / الضامة ، وكذلك إنتاج السيتوكينات والكيموكينيات البرولية. بعد حل الالتهاب ، تنتقل البيئة إلى حالة أكثر دقة مع تحريض السيتوكينات الليفية وproangiogenic وعوامل النمو. يتم إيداع أنسجة الحبيبات وتشكيل الأوعية الجديدة مع هجرة الخلايا الليفية العضلية والخلايا الليفية والخلايا الظهارية والخلايا النُظفية. في المراحل النهائية ، يتم إعادة تشكيل المصفوفة المؤقتة خارج الخلية ، وينطلق تشكيل الندبة وإغلاق الجرح2،3،4،5،6،7،8.
لا يوجد نموذج واحد من المورين يوفر نظامًا لدراسة جميع مراحل التئام الجروح2. هنا ، يتم وصف نموذجين للجرح الجراحي: واحد يوضح استجابات التئام الجروح الخلوية الحادة والسيتوكين ، والآخر يسمح بتقييم إغلاق الجروح وكذلك التحليلات النسيجية. ويمكن استخدام هاتين الطريقتين بطريقة تكميلية لتقييم آثار اضطراب أو مراضة مشتركة على جوانب مختلفة من استجابة التئام الجروح. الزرع تحت الجلد الظهري لإسفنجة الكحول متعدد الفينيل (PVA) هو نظام تم استخدامه في نماذج القوارض لعقود لتوضيح العديد من جوانب استجابات الأنسجة الخلوية والتحبيب9،10،11,،12،13،14،15،16،17،18،1919،20 ،21،22،23،24. يسمح هذا النهج باسترجاع سوائل الجروح الغنية بالسيتوكين والتسلل الخلوي. في هذا النموذج، يتم وضع 1 سم × 1 سم × 0.5 سم قطعة من الإسفنج PVA في جيوب تحت الجلد من خلال شق 2 سم المحرز في خط الوسط الظهرالخلفي. يتم إغلاق الشق مع مقاطع جراحية، ويمكن استرداد الإسفنج في نقاط زمنية لاحقة لعزل الخلايا والسوائل. يعكس الوسط الخلوي والسيتوكيني من الإسفنج المعزول المراحل الطبيعية لشفاء الجروح الحادة حتى حوالي 14 يومًا بعد الزرع. في وقت لاحق نقاط النموذج هو أكثر فائدة لدراسة تكوين الأنسجة التحبيب واستجابة الجسم الغريب1. مع هذا النظام، فمن الممكن لعزل > 106 خلايا، والذي يوفر ميزة متميزة للمقالات البهينوتيك والوظيفية وعزل الحمض النووي الريبي، على عزل الخلايا من غيرها من الأساليب القائمة على خزعة1،,22،,23،,25، 26,26.
يتم تحديد معدل إغلاق الجرح باستخدام نموذج استئصال الجلد الذيل. في هذا النموذج، كما وصفها في البداية من قبل Falanga وآخرون، وأبلغ عنها من قبل الآخرين27،28،29،30، تتم إزالة 1 سم × 0.3 سم قسم سمك كامل من الجلد الذيل بالقرب من قاعدة الذيل. يتم تصور منطقة الجرح بسهولة ويمكن قياسها مع مرور الوقت. بدلا ً من ذلك، يمكن عزل أنسجة الذيل للتحليل النسيجي. يمكن استخدام هذا النهج كبديل أو بالتزامن مع طريقة خزعة لكمة الظهر الراسخة. التمييز الأساسي بين هذين النموذجين هو معدل إغلاق الجروح ، ووجود أو عدم وجود الفراء ، وبنية الجلد2،31،32. الجروح الجلد الذيل توفر فترة زمنية أطول لتقييم إغلاق الجرح، كما يستغرق ما يقرب من 21 يوما لإغلاق كامل أن يحدث. هذا يعارض خزعات لكمة الظهرية unsinted ، والتي تلتئم بشكل أسرع بكثير (~ 7-10 أيام) ، في المقام الأول عن طريق الانكماش بسبب عمل carnosus panniculus. تلتئم خزعات اللكمة الظهرية المنجلية ببطء أكبر وتقلل من آثار شفاء العقد ، ولكن تعتمد على وجود جسم غريب لتقييد الآليات القائمة على العقد1،2،27،30،31،33.33
نماذج الجرح الموصوفة مفيدة لفهم عمليات التئام الجروح العادية في حالة عدم وجود اضطراب. في حين أن شفاء جلد القوارض يختلف بطرق هامة جدا من الجلد البشري، بما في ذلك بنية فضفاضة، والاعتماد على الشفاء العقدي، وغيرها من الاختلافات التشريحية، ونظام مورين يقدم مزايا معينة لدراسات ميكانيكية وفحص. وفي مقدمتها توافر سلالات أصيلة ومسوخ وراثية، وقابلية وراثية، وانخفاض التكلفة. يمكن ترجمة البصيرة الميكانيكية المكتسبة من دراسات المورين إلى نماذج الحيوانات المعقدة التي تحاكي عن كثب شفاء الجلد البشري ، مثل نظام porcine2،31.
بالإضافة إلى فحص استجابات التئام الجروح في الحالة الثابتة ، يمكن الجمع بين هذه النماذج مع ظروف المرض لفهم أساس عيوب التئام الجروح في المستوى الخلوي والسيتوكين وإجمالي الأنسجة. في هذا الإعداد الخاص يمكن استخدام النموذجين بالتنسيق لتقييم آثار حالة مرضية معينة ، مثل الالتهاب الرئوي بعد الجراحة ، على كل من استجابة التئام الجروح الخلوية الحادة ومعدل إغلاق الجروح30.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المقالة نموذجين للجرح المورين قابل للمسار يسمحان بتقييم استجابة التئام الجروح الحادة. تتضمن الطريقة الأولى الزرع الجراحي لإسفنج PVA في الفضاء تحت الجلد الظهري. هذا النهج يوفر ميزة متميزة على نماذج الجروح القائمة على خزعة لدراسة استجابة التئام الجروح الخلوية بسبب العدد الكبير من ا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفان أن يشكرا كيفن كارلسون من مرفق قياس وفرز التدفق في جامعة براون للتشاور والمساعدة في تجارب قياس الخلايا المتدفقة. تم إنشاء الصور في الشكل 1B و C مع BioRender. وشكر كايلا لي وغريغوري سيربا على مساعدتهما في التصوير الفوتوغرافي. تم دعم هذا العمل من خلال منح من التالي: وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاعية (DARPA) YFAA15 D15AP00100، عميد مجالات جائزة العلوم الجديدة الناشئة (جامعة براون)، المعهد الوطني لرئة القلب والدم (NHLBI) 1R01HL126887-01A1، المعهد الوطني للعلوم البيئية T32-ES7272 (التدريب في علم الأمراض البيئية)، وجائزة بذور البحوث في جامعة براون.
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
Riferimenti
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
- Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
- Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
- Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
- Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
- Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
- Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
- Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
- Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
- Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
- Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
- Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
- MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
- Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
- Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
- Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
- Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
- Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
- Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
- Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
- Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
- Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
- Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
- Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
- Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
- Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
- Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
- Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
- DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
- Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
- Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).
