डॉरसल सबक्यूटेनेस पॉलीविनाइल अल्कोहल स्पंज इम्प्लांटेशन और एक्सीशनल टेल स्किन घाव मॉडल का उपयोग करके तीव्र घाव उपचार का आकलन।
Summary
यहां, दो मूत्र घाव चिकित्सा मॉडल वर्णित हैं, एक सेलुलर और साइटोकिन घाव चिकित्सा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और दूसरा घाव बंद होने की दर की मात्रा निर्धारित करने के लिए । इन तरीकों का उपयोग खराब घाव उपचार के विभिन्न पहलुओं के तंत्र को निर्धारित करने के लिए मधुमेह जैसे जटिल रोग मॉडल के साथ किया जा सकता है।
Abstract
घाव उपचार एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए सूजन, ग्रैनुलेशन ऊतक गठन, फाइब्रोसिस और संकल्प की व्यवस्थित प्रगति की आवश्यकता होती है। Murine मॉडल इन प्रक्रियाओं में मूल्यवान मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं; हालांकि, कोई भी मॉडल घाव भरने की प्रतिक्रिया के सभी पहलुओं को पूरी तरह से संबोधित नहीं करता है। इसके बजाय, घाव भरने के विभिन्न पहलुओं को संबोधित करने के लिए कई मॉडलों का उपयोग करना आदर्श है। यहां, घाव भरने की प्रतिक्रिया के विविध पहलुओं को संबोधित करने वाले दो अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है। पहले मॉडल में, पॉलीविनाइल अल्कोहल स्पंज को माउस डोरसम के साथ कम मात्रा में प्रत्यारोपित किया जाता है। स्पंज पुनर्प्राप्ति के बाद, कोशिकाओं को यांत्रिक व्यवधान द्वारा अलग किया जा सकता है, और तरल पदार्थ केंद्रीकरण द्वारा निकाले जा सकते हैं, इस प्रकार तीव्र घाव वातावरण में सेलुलर और साइटोकिन प्रतिक्रियाओं के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। इस मॉडल की एक सीमा घाव बंद होने की दर का आकलन करने में असमर्थता है। इसके लिए टेल स्किन एक्सिडेंट मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है। इस मॉडल में, पूंछ त्वचा का 10 मिमी x 3 मिमी आयताकार टुकड़ा पृष्ठीय सतह के साथ, पूंछ के आधार के पास उत्पादित किया जाता है। इस मॉडल को उपचार दरों का निर्धारण करने के लिए प्लैनिमेट्रिक विश्लेषण के लिए आसानी से फोटो खिंचवाई जा सकती है और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए उत्पादित किया जा सकता है। दोनों वर्णित तरीकों का उपयोग आनुवंशिक रूप से परिवर्तित माउस उपभेदों में किया जा सकता है, या घाव चिकित्सा तंत्र को स्पष्ट करने के लिए मधुमेह, उम्र बढ़ने या माध्यमिक संक्रमण जैसे कोमोर्बिड स्थितियों के मॉडल के साथ संयोजन के रूप में।
Introduction
घाव भरने की प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए कई मूत्र मॉडल प्रणालियां उपलब्ध हैं, प्रत्येक विशिष्ट लाभ और सीमाएं1,,2रखते हैं। निम्नलिखित विधियां दो मूत्र घाव मॉडल प्रस्तुत करती हैं, जिनमें से प्रत्येक घाव उपचार प्रतिक्रिया के एक विशेष पहलू को संबोधित करती है, और जिसका उपयोग चोट के जवाब में क्षोभ के कारण और प्रभाव की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। घाव भरने की प्रक्रिया अलग-अलग चरणों में होती है। पहला चरण भड़काऊ है, जिसकी विशेषता प्लेटलेट्स, न्यूट्रोफिल, और मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज की तेजी से आमद के साथ-साथ भड़काऊ साइटोकिन्स और केमोकिन्स का उत्पादन भी है । सूजन के समाधान के बाद, पर्यावरण प्रोसिब्रोटिक और प्रोएंजियोजेनिक साइटोकिन्स और विकास कारकों को शामिल करने के साथ अधिक प्रतिकार स्थिति में संक्रमण करता है। ग्रैनुलेशन ऊतक जमा किया जाता है और नियोवेसल मायोफीब्रोब्लास्ट, फाइब्रोब्लास्ट, एपिथेलियल कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रवास के साथ बनते हैं। अंतिम चरण में, अनंतिम बाह्युशिकी मैट्रिक्स को फिर से तैयार किया जाता है, और निशान गठन और घाव बंद करने,से2,3,44,,5,,6,,7,,8आय होती है।
कोई भी मूत्र मॉडल घाव भरने के सभी चरणों का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है2। यहां, दो सर्जिकल घाव मॉडल वर्णित हैं: एक तीव्र सेलुलर और साइटोकिन घाव उपचार प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट करता है, और दूसरा घाव बंद होने के साथ-साथ हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के आकलन के लिए अनुमति देता है। इन दो तरीकों को घाव उपचार प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं पर क्षोभ या comorbidity के प्रभावका आकलन करने के लिए एक पूरक फैशन में नियोजित किया जा सकता है। पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) स्पंज का पृष्ठीय चमड़े का प्रत्यारोपण एक ऐसी प्रणाली है जिसका उपयोग दशकों से कृंतक मॉडलों में सेलुलर और ग्रेनुलेशन ऊतक प्रतिक्रियाओं के कई पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए किया जाता रहा है9,,10,,11,,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19,,20 ,21,22,23,24. यह दृष्टिकोण साइटोकिन-समृद्ध घाव तरल पदार्थ और सेलुलर घुसपैठ की पुनर्प्राप्ति के लिए अनुमति देता है। इस मॉडल में, पीवीए स्पंज के 1 सेमी x 1 सेमी x 0.5 सेमी टुकड़ों को पीछे के पृष्ठीय मिडलाइन पर बने 2 सेमी चीरा के माध्यम से चमड़े के नीचे जेब में रखा जाता है। चीरा शल्य चिकित्सा क्लिप के साथ बंद कर दिया है, और स्पंज सेल और तरल पदार्थ अलगाव के लिए बाद के समय अंक पर प्राप्त किया जा सकता है । अलग स्पंज के सेलुलर और साइटोकिन परिवेश तीव्र घाव के सामान्य चरणों को दर्शाता है लगभग 14 दिनों के postimplantation तक उपचार। बाद के समय में अंक मॉडल ग्रेनेशन ऊतक गठन और विदेशी शरीर प्रतिक्रिया1का अध्ययन करने के लिए अधिक लाभप्रद है । इस प्रणाली के साथ, अन्य बायोप्सी आधारित,23,25,तरीकों,22सेकोशिकाओं को अलग करने पर फेनोटाइपिक और कार्यात्मक परख और आरएनए अलगाव के लिए एक अलग लाभ प्रदान करने वाली 106 कोशिकाओं को अलग करना संभवहै।
घाव बंद करने की दर पूंछ त्वचा एक्सिजन मॉडल का उपयोग कर निर्धारित की जाती है। इस मॉडल में, जैसा कि शुरू में फांगा एट अल द्वारा वर्णित है और अन्य द्वारा रिपोर्ट किया गया है27,,28,,29,,30,पूंछ त्वचा का 1 सेमी x 0.3 सेमी पूर्ण मोटाई अनुभाग पूंछ के आधार के पास हटा दिया जाता है। घाव क्षेत्र आसानी से कल्पना की जाती है और समय के साथ मापा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पूंछ ऊतक को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए अलग किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग अच्छी तरह से स्थापित पृष्ठीय पंच बायोप्सी विधि के साथ या संयोजन के रूप में एक विकल्प के रूप में किया जा सकता है। इन दोनों मॉडलों के बीच प्राथमिक भेद घाव बंद करने की दर,2फर की उपस्थिति या अनुपस्थिति, और त्वचा संरचना2,31,,32हैं। पूंछ त्वचा के घाव एक लंबी समय सीमा प्रदान करते हैं जिसमें घाव बंद होने का आकलन करना है, क्योंकि पूर्ण बंद होने में लगभग 21 दिन लगते हैं। यह अप्लीटेड पृष्ठीय पंच बायोप्सी का विरोध करता है, जो मुख्य रूप से पैनिकुलस कार्नोस स की कार्रवाई के कारण संकुचन से बहुत तेजी से (~ 7-10 दिन) को ठीक करता है। स्प्लिटेड पृष्ठीय पंच बायोप्सी अधिक धीरे-धीरे ठीक होती है और संकुचन उपचार के प्रभाव को कम1करती है, लेकिन संकुचन आधारित तंत्र1,2,,27,,30,,31,,33को प्रतिबंधित करने के लिए विदेशी शरीर की उपस्थिति पर भरोसा करती हैं।
वर्णित घाव मॉडल क्षोभ के अभाव में सामान्य घाव उपचार प्रक्रियाओं को समझने के लिए जानकारीपूर्ण हैं। जबकि कृंतक त्वचा का उपचार मानव त्वचा से बहुत महत्वपूर्ण तरीकों से अलग है, जिसमें ढीली संरचना, संकुचन चिकित्सा पर निर्भरता, और अन्य शारीरिक मतभेद शामिल हैं, मूत्र प्रणाली मशीनी और स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए कुछ फायदे प्रदान करती है। इनमें सबसे महत्वपूर्ण यह है कि नस्ल उपभेदों और आनुवंशिक म्यूटेंट, आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी और कम लागत की उपलब्धता है। मेरिन अध्ययन से प्राप्त मशीनी अंतर्दृष्टि का अनुवाद जटिल पशु मॉडलों में किया जा सकता है जो मानव त्वचा उपचार की अधिक बारीकी से नकल करते हैं, जैसे पोर्सिन सिस्टम2,,31।
स्थिर स्थिति में घाव चिकित्सा प्रतिक्रियाओं की जांच के अलावा, इन मॉडलों को सेलुलर, साइटोकिन और सकल ऊतक स्तर पर घाव चिकित्सा दोषों के आधार को समझने के लिए comorbid शर्तों के साथ जोड़ा जा सकता है। यह इस विशेष सेटिंग में है कि दो मॉडलों को एक विशेष कोमोरबिड स्थिति के प्रभावों का आकलन करने के लिए संगीत कार्यक्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि पश्चात निमोनिया, तीव्र सेलुलर घाव उपचार प्रतिक्रिया और घाव बंद करने की दर30पर।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख दो ट्रैक्टेबल क्यूरीन घाव मॉडल का वर्णन करता है जो तीव्र घाव उपचार प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं। पहली विधि में पृष्ठीय चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में पीवीए स्पंज की शल्य चिकित्स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ब्राउन विश्वविद्यालय फ्लो साइटोमेट्री और छंटाई सुविधा के केविन कार्लसन को प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों के साथ परामर्श और सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्र 1 B और C में छवियां बायोरेंडर के साथ बनाई गई थीं। कायला ली और ग्रेगरी सेरपा को उनकी फोटो सहायता के लिए धन्यवाद दिया जाता है । इस काम को निम्नलिखित से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाएं एजेंसी (DARPA) YFAA15 D15AP00100, उभरते नए विज्ञान पुरस्कार (ब्राउन विश्वविद्यालय), राष्ट्रीय हृदय फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI) 1R01HL126887-01A1 के डीन क्षेत्रों, राष्ट्रीय पर्यावरण विज्ञान संस्थान (NIES) T32-ES7272 (पर्यावरण विकृति में प्रशिक्षण), और ब्राउन विश्वविद्यालय अनुसंधान बीज पुरस्कार ।
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
Riferimenti
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
- Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
- Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
- Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
- Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
- Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
- Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
- Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
- Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
- Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
- Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
- Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
- MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
- Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
- Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
- Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
- Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
- Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
- Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
- Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
- Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
- Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
- Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
- Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
- Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
- Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
- Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
- Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
- DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
- Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
- Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).
