Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.
Summary
Qui vengono descritti due modelli di guarigione delle ferite murine, uno progettato per valutare le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina e l’altro per quantificare il tasso di chiusura della ferita. Questi metodi possono essere utilizzati con modelli di malattia complessi come il diabete per determinare i meccanismi di vari aspetti della scarsa guarigione delle ferite.
Abstract
La guarigione delle ferite è un processo complesso che richiede la progressione ordinata dell’infiammazione, la formazione del tessuto granulosa, la fibrosi e la risoluzione. I modelli Murine forniscono preziose informazioni meccanicistiche su questi processi; tuttavia, nessun singolo modello affronta completamente tutti gli aspetti della risposta di guarigione della ferita. Invece, è ideale utilizzare più modelli per affrontare i diversi aspetti della guarigione della ferita. Qui vengono descritti due diversi metodi che affrontano diversi aspetti della risposta di guarigione della ferita. Nel primo modello, le spugne di alcool polivinile sono impiantate sottocutaneamente lungo il dorsum del topo. Dopo il recupero della spugna, le cellule possono essere isolate da interruzioni meccaniche e i fluidi possono essere estratti dalla centrifugazione, consentendo così una caratterizzazione dettagliata delle risposte cellulari e citochine nell’ambiente della ferita acuta. Una limitazione di questo modello è l’incapacità di valutare il tasso di chiusura della ferita. Per questo, viene utilizzato un modello di escissione della pelle della coda. In questo modello, un pezzo rettangolare di coda da 10 mm x 3 mm viene espulso lungo la superficie dorsale, vicino alla base della coda. Questo modello può essere facilmente fotografato per l’analisi planimetrica per determinare i tassi di guarigione e può essere assolto per l’analisi istologica. Entrambi i metodi descritti possono essere utilizzati in ceppi di topi geneticamente alterati, o in combinazione con modelli di condizioni comorbide, come diabete, invecchiamento o infezione secondaria, al fine di chiarire i meccanismi di guarigione della ferita.
Introduction
Ci sono molti sistemi modello murine disponibili per esaminare i processi di guarigione delle ferite, ognuno dei quali possiede vantaggi e limitazioni specifici1,2. I seguenti metodi presentano due modelli di ferite murine, ognuno dei quali affronta un particolare aspetto della risposta di guarigione della ferita e che può essere utilizzato per identificare la causa e l’effetto delle perturbazioni nella risposta alla lesione. Il processo di guarigione delle ferite avviene in fasi distinte. La prima fase è infiammatoria, caratterizzata dal rapido afflusso di piastrine, neutrofili e monociti/macrofagi, nonché dalla produzione di citochine infiammatorie e chemiochine. Dopo la risoluzione dell’infiammazione, l’ambiente passa a uno stato più riparativo con l’induzione di citochine profibrotiche e proangiogeniche e fattori di crescita. Il tessuto di granulazione si deposita e i neovessels si formano con la migrazione di miofibroblasti, fibroblasti, cellule epiteliali e cellule endoteliali. Nelle fasi finali, la matrice extracellulare provvisoria viene rimodellata e la formazione di cicatrici e la chiusura delle ferite procede2,3,4,5,6,7,8.
Nessun singolo modello murino fornisce un sistema per studiare tutte le fasi della guarigione delle ferite2. Qui vengono descritti due modelli chirurgici di ferita: uno chiarisce le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina acuta, e l’altro consente la valutazione della chiusura della ferita e delle analisi istologiche. Questi due metodi possono essere impiegati in modo complementare per valutare gli effetti di una perturbazione o comorbidità su diversi aspetti della risposta di guarigione della ferita. L’impianto sottocutaneo dorsale di spugne di alcool polivinile (PVA) è un sistema che è stato utilizzato nei modelli di roditori per decenni per chiarire numerosi aspetti delle risposte cellulari e granulare del tessuto9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Questo approccio consente il recupero di fluidi di ferita ricchi di citochine e infiltrati cellulari. In questo modello, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm pezzi di spugna PVA vengono posti in tasche sottocutanee attraverso un’incisione di 2 cm fatta alla linea mediana posteriore. L’incisione è chiusa con clip chirurgiche e le spugne possono essere recuperate in momenti successivi per l’isolamento cellulare e fluido. L’ambiente cellulare e citochina delle spugne isolate riflette le normali fasi di guarigione acuta della ferita fino a circa 14 giorni di postimplantation. In momenti successivi il modello è più vantaggioso per lo studio della formazione del tessuto granulosa e della risposta del corpo estraneo1. Con questo sistema, è possibile isolare >106 cellule, che offre un netto vantaggio per i saggi fenotipici e funzionali e l’isolamento dell’RNA, rispetto alle cellule isolate da altri metodi basati sulla biopsia1,22,23,25,26.26
La velocità di chiusura della ferita è determinata utilizzando il modello di escissione della pelle della coda. In questo modello, come inizialmente descritto da Falanga et al. e riportato da altri27,28,29,30, una sezione di 1 cm x 0,3 cm di spessore pieno della pelle della coda viene rimosso vicino alla base della coda. L’area della ferita è facilmente visualizzabile e può essere misurata nel tempo. In alternativa, il tessuto della coda può essere isolato per l’analisi istologica. Questo approccio può essere utilizzato come alternativa o in combinazione con il metodo ben consolidato della biopsia del pugno dorsale. Le distinzioni principali tra questi due modelli sono il tasso di chiusura della ferita, la presenza o l’assenza di pelliccia, e la struttura della pelle2,31,32. Le ferite della pelle della coda offrono un lasso di tempo più lungo in cui valutare la chiusura della ferita, in quanto ci vogliono circa 21 giorni per la chiusura completa. Questo si oppone alle biopsie di pugno dorsale non sfuse, che guariscono molto più velocemente (7-10 giorni), principalmente con la contrazione dovuta all’azione del panniculus carnosus. Le biopsie di punzone dorsali sfumate guariscono più lentamente e diminuiscono gli effetti della guarigione contrattile, ma si basano sulla presenza di un corpo estraneo per limitare i meccanismi contrattili1,2,27,30,31,33.
I modelli di ferita descritti sono informativi per comprendere i normali processi di guarigione delle ferite in assenza di perturbazione. Mentre la guarigione della pelle dei roditori differisce in modo molto significativo dalla pelle umana, tra cui la struttura allentata, la dipendenza dalla guarigione contrattile e altre differenze anatomiche, il sistema murino offre alcuni vantaggi per gli studi meccanicistici e di screening. In primo luogo è la disponibilità di ceppi inbred e mutanti genetici, trattatibilità genetica, e costi inferiori. Le intuizioni meccanicistiche acquisite dagli studi murini possono essere tradotte in modelli animali complessi che imitano più da vicino la guarigione della pelle umana, come il sistema di suini2,31.
Oltre a esaminare le risposte di guarigione della ferita nello stato stabile, questi modelli possono essere combinati con condizioni comorbide per comprendere la base dei difetti di guarigione della ferita a livello cellulare, citochine e tessuto lordo. È in questa particolare impostazione che i due modelli possono essere utilizzati in concerto per valutare gli effetti di una particolare condizione comorbida, come la polmonite postoperatoria, sia sulla risposta di guarigione della ferita cellulare acuta30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive due modelli di ferite murine trattabili che consentono la valutazione della risposta di guarigione acuta della ferita. Il primo metodo prevede l’impianto chirurgico di spugne PVA nello spazio sottocutaneo dorsale. Questo approccio offre un netto vantaggio rispetto ai modelli di ferita basati sulla biopsia per studiare la risposta di guarigione cellulare della ferita a causa del gran numero di cellule e della quantità di fluidi della ferita ottenuti dalle spugne isolate. Per la riuscita esecuzion…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Kevin Carlson del Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility per la consultazione e l’assistenza con esperimenti di citometria di flusso. Immagini in Figura 1B e C sono state create con BioRender. Kayla Lee e Gregory Serpa sono ringraziati per la loro assistenza fotografica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dei seguenti: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean’s Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Formazione in Patologia Ambientale) e il Brown University Research Seed Award.
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
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