Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

Summary

Aquí, se describen dos modelos de cicatrización de heridas murinas, uno diseñado para evaluar las respuestas de cicatrización de heridas celulares y citoquinas y el otro para cuantificar la tasa de cierre de heridas. Estos métodos se pueden utilizar con modelos de enfermedades complejas como la diabetes para determinar los mecanismos de varios aspectos de la cicatrización deficiente de heridas.

Abstract

La cicatrización de heridas es un proceso complejo que requiere la progresión ordenada de la inflamación, la formación de tejido de granulación, la fibrosis y la resolución. Los modelos murinos proporcionan una valiosa visión mecanicista de estos procesos; sin embargo, ningún modelo solo aborda completamente todos los aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. En su lugar, es ideal utilizar varios modelos para abordar los diferentes aspectos de la cicatrización de heridas. Aquí, se describen dos métodos diferentes que abordan diversos aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. En el primer modelo, las esponjas de alcohol polivinílico se implantan por vía subcutánea a lo largo del dorso del ratón. Después de la recuperación de la esponja, las células pueden ser aisladas por interrupción mecánica, y los fluidos se pueden extraer por centrifugación, lo que permite una caracterización detallada de las respuestas celulares y de citoquinas en el ambiente agudo de la herida. Una limitación de este modelo es la incapacidad de evaluar la tasa de cierre de la herida. Para ello, se utiliza un modelo de escisión de la piel de la cola. En este modelo, una pieza rectangular de 10 mm x 3 mm de piel de cola se extirpada a lo largo de la superficie dorsal, cerca de la base de la cola. Este modelo se puede fotografiar fácilmente para el análisis planimétrico para determinar las tasas de curación y se puede extirpar para el análisis histológico. Ambos métodos descritos se pueden utilizar en cepas de ratón genéticamente alteradas, o en combinación con modelos de condiciones comorbilidades, como diabetes, envejecimiento o infección secundaria, con el fin de dilucidar los mecanismos de cicatrización de heridas.

Introduction

Hay muchos sistemas de modelos murinos disponibles para examinar los procesos de cicatrización de heridas, cada uno posee ventajas y limitaciones específicas^1,,2. Los siguientes métodos presentan dos modelos de heridas murinas, cada uno de los cuales aborda un aspecto particular de la respuesta de cicatrización de heridas, y que se pueden utilizar para identificar la causa y el efecto de las perturbaciones en la respuesta a la lesión. El proceso de cicatrización de heridas ocurre en fases distintas. La primera fase es inflamatoria, caracterizada por la rápida afluencia de plaquetas, neutrófilos y monocitos/macrófagos, así como la producción de citoquinas proinflamatorias y quimioquinas. Tras la resolución de la inflamación, el medio ambiente pasa a un estado más reparador con la inducción de citoquinas y factores de crecimiento profisóxicos y proangiogénicos. El tejido de granulación se deposita y los neovasculares se forman con la migración de miofibroblastos, fibroblastos, células epiteliales y células endoteliales. En las etapas finales, se remodela la matriz extracelular provisional, y la formación de cicatrices y el cierre de la herida procede^{2,3,4,5,6,7,8}.

Ningún modelo murino proporciona un sistema para estudiar todas las etapas de la cicatrización de heridas². Aquí, se describen dos modelos quirúrgicos de heridas: uno aclara las respuestas agudas de cicatrización celular y citoquina, y el otro permite la evaluación del cierre de la herida, así como análisis histológicos. Estos dos métodos pueden emplearse de manera complementaria para evaluar los efectos de una perturbación o comorbilidad en diferentes aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. La implantación dorsal subcutánea de esponjas de alcohol polivinílico (PVA) es un sistema que se ha utilizado en modelos de roedores durante décadas para esclarecer numerosos aspectos de las respuestas celulares y granulados de tejido^{s9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24}. Este enfoque permite la recuperación de líquidos de heridas ricos en citoquinas e infiltrados celulares. En este modelo, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm trozos de esponja PVA se colocan en bolsillos subcutáneos a través de una incisión de 2 cm realizada en la línea media dorsal posterior. La incisión se cierra con clips quirúrgicos, y las esponjas se pueden recuperar en puntos de tiempo posteriores para el aislamiento celular y fluido. El ambiente celular y citoquina de las esponjas aisladas refleja las etapas normales de la cicatrización aguda de heridas hasta unos 14 días después de la implantación. En los puntos de tiempo posteriores el modelo es más ventajoso para el estudio de la formación de tejido de granulación y la respuesta del cuerpo extraño¹. Con este sistema, es posible aislar >10⁶ células, lo que ofrece una clara ventaja para ensayos fenotípicos y funcionales y aislamiento de ARN, sobre células de aislamiento de otros métodos basados en biopsias^{1,22,23,25,26}.

La tasa de cierre de la herida se determina utilizando el modelo de escisión de la piel de la cola. En este modelo, como se describe inicialmente por Falanga et al. e informado por otros^27,28,29,30, una sección de espesor completo de 1 cm x 0,3 cm de la piel de la cola se elimina cerca de la base de la cola. El área de la herida se visualiza fácilmente y se puede medir con el tiempo. Alternativamente, el tejido de la cola se puede aislar para el análisis histológico. Este enfoque se puede utilizar como una alternativa o en conjunto con el método de biopsia de punzonado dorsal bien establecido. Las principales distinciones entre estos dos modelos son la tasa de cierre de²la herida, la presencia o ausencia de piel, y la estructura de la piel^2,31,,32. Las heridas de la piel de la cola ofrecen un plazo más largo para evaluar el cierre de la herida, ya que se necesitan aproximadamente 21 días para que se produzca un cierre completo. Esto se opone a las biopsias de punzón dorsal sin esplinar, que sanan mucho más rápido (7-10 días), principalmente por contracción debido a la acción del panniculus carnosus. Las biopsias de punzón dorsal astillado sanan más lentamente y disminuyen los efectos de la curación contráctela, pero dependen de la presencia de un cuerpo extraño para restringir los mecanismos basados en contrámenes^{1,,2,27,30,31,33}.

Los modelos de heridas descritos son informativos para entender los procesos normales de cicatrización de heridas en ausencia de perturbación. Mientras que la curación de la piel de los roedores difiere de maneras muy significativas de la piel humana, incluyendo la estructura suelta, la dependencia de la curación contráctea, y otras diferencias anatómicas, el sistema murino ofrece ciertas ventajas para los estudios mecanicistas y de cribado. El principal de ellos es la disponibilidad de cepas endogámicas y mutantes genéticos, la tractabilidad genética y un menor costo. La visión mecanicista obtenida de los estudios murinos se puede traducir a modelos animales complejos que imitan más de cerca la cicatrización de la piel humana, como el sistema porcino^2,,31.

Además de examinar las respuestas de cicatrización de heridas en el estado estacionario, estos modelos se pueden combinar con condiciones comorbilidades para entender la base de los defectos de cicatrización de heridas a nivel celular, citoquina y tejido bruto. Es en este entorno particular que los dos modelos se pueden utilizar en concierto para evaluar los efectos de una condición comorbilidad particular, como la neumonía postoperatoria, tanto en la respuesta de cicatrización de heridas celulares agudas como en la tasa de cierre de la herida³⁰.

Protocol

Todos los estudios en animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Brown y llevados a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de los Institutos Nacionales de Salud.  NOTA: en el vídeo, la cortina quirúrgica se ha omitido con fines de demostración. 1. Implantación subcutánea de esponjas de PVA Utilice tijeras para cortar láminas de esponja PVA en piezas de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Rehidra…

Representative Results

Respuesta inflamatoria sistémica tras la implantación de la esponja de PVALa cirugía de implantación de esponja PVA generó una respuesta inflamatoria sistémica, como lo demuestra la inducción de IL-6 en el plasma 1 día después de la herida(Figura 2A). Otras citoquinas proinflamatorias, incluyendo TNF-o e IL-1, así como una serie de quimioquinas incluyendo CCL2 y CXCL1 fueron inducidas sistémicamente en los primeros 7 días después de la implantación de la es…

Discussion

Este artículo describe dos modelos de heridas murinas tractables que permiten la evaluación de la respuesta aguda de cicatrización de heridas. El primer método consiste en la implantación quirúrgica de esponjas de PVA en el espacio subcutáneo dorsal. Este enfoque ofrece una clara ventaja sobre los modelos de heridas basadas en biopsias para estudiar la respuesta de cicatrización de heridas celulares debido al gran número de células y la cantidad de líquidos de la herida obtenidos de las esponjas aisladas. Para…

Materials

10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus	Genesee	28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red)	ThermoFisher Scientific	14025076
5ml Syringe	BD	309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750	BioLegend	109852	Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660	ThermoFisher Scientific	50-4801-82	Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC	BD Biosciences	553104	Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710	ThermoFisher Scientific	46-9668-82	Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700	BD Biosciences	565183	Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier	Braintree Scientific	NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm	Braintree Scientific	NC9334081
Blender Bag, 80mL	Fisher Scientific	14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100	Genesee Scientific	21-130
Fetal Bovine Serum – Standard	ThermoFisher Scientific	10437028
Fixable Viability Dye eFluor506	ThermoFisher Scientific	65-0866-14
Hepes Solution, 1M	Genesee Scientific	25-534
ImageJ Software	NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size	Ivalon/PVA Unlimited		www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10%	Fisher Scientific	3955-16
Spray barrier film, Cavilon	3M	3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V	Seward	0080/000/AJ