Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models.

Summary

Hier worden twee murine wondgenezingsmodellen beschreven, een ontworpen om cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties te beoordelen en de andere om de snelheid van wondsluiting te kwantificeren. Deze methoden kunnen worden gebruikt met complexe ziektemodellen zoals diabetes om mechanismen van verschillende aspecten van slechte wondgenezing te bepalen.

Abstract

Wondgenezing is een complex proces dat de ordelijke progressie van ontsteking, granulatieweefselvorming, fibrose en resolutie vereist. Murinemodellen bieden waardevol mechanistisch inzicht in deze processen; echter, geen enkel model volledig adressen alle aspecten van de wondgenezing reactie. In plaats daarvan is het ideaal om meerdere modellen te gebruiken om de verschillende aspecten van wondgenezing aan te pakken. Hier worden twee verschillende methoden beschreven die betrekking hebben op diverse aspecten van de wondgenezingsrespons. In het eerste model worden polyvinyl alcoholsponzen onderhuids geïmplanteerd langs de muisdorsum. Na het ophalen van spons, cellen kunnen worden geïsoleerd door mechanische verstoring, en vloeistoffen kunnen worden geëxtraheerd door centrifugering, waardoor een gedetailleerde karakterisering van cellulaire en cytokine reacties in de acute wond omgeving. Een beperking van dit model is het onvermogen om de snelheid van wondsluiting te beoordelen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een staarthuidexcisiemodel. In dit model wordt een rechthoekig stuk staarthuid van 10 mm x 3 mm uitgesneden langs het rugoppervlak, in de buurt van de basis van de staart. Dit model kan gemakkelijk worden gefotografeerd voor planimetrische analyse om genezingtarieven te bepalen en kan worden weggesneden voor histologische analyse. Beide beschreven methoden kunnen worden gebruikt in genetisch veranderde muizenstammen, of in combinatie met modellen van comorbide aandoeningen, zoals diabetes, veroudering of secundaire infectie, om wondgenezingsmechanismen op te helderen.

Introduction

Er zijn veel murine model systemen beschikbaar om wondgenezing processen te onderzoeken, elk met specifieke voordelen en beperkingen^1,2. De volgende methoden presenteren twee murinewondmodellen, die elk een bepaald aspect van de wondgenezingsrespons aandeorde, en die kunnen worden gebruikt om de oorzaak en het effect van verstoringen in de reactie op letsel te identificeren. Het proces van wondgenezing vindt plaats in verschillende fasen. De eerste fase is inflammatoir, gekenmerkt door de snelle instroom van bloedplaatjes, neutrofielen en monocyten/macrofagen, evenals de productie van ontstekingscytokines en chemokines. Na de oplossing van ontsteking, de omgeving overgangen naar een meer herstellende toestand met de inductie van profibrotische en proangiogene cytokines en groeifactoren. Granulatieweefsel wordt afgezet en neovessels vormen zich met de migratie van myofibroblasten, fibroblasten, epitheelcellen en endotheelcellen. In de laatste fase wordt de voorlopige extracellulaire matrix gerenoveerd en verloopt littekenvorming en wondsluiting^{2,3,4,5,6,7,8}.

Geen enkel murinemodel biedt een systeem om alle stadia van wondgenezing te bestuderen². Hier worden twee chirurgische wondmodellen beschreven: de ene verduidelijkt acute cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties, en de andere maakt de beoordeling van wondsluiting en histologische analyses mogelijk. Deze twee methoden kunnen op complementaire wijze worden gebruikt om de effecten van een verstoring of comorbiditeit op verschillende aspecten van de wondgenezingsrespons te beoordelen. De dorsale onderhuidse implantatie van polyvinyl alcohol (PVA) sponzen is een systeem dat is gebruikt in knaagdiermodellen voor decennia tot tal van aspecten van cellulaire en granulatie weefsel reacties^{9,,10,11,12,14,,15,16,17},^18,19,20^{,1420 ,21,22,23,24}. Deze aanpak maakt het ophalen van cytokine-rijke wondvloeistoffen en cellulaire infiltreert. In dit model worden 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stukken PVA-spons in onderhuidse zakken geplaatst door middel van een incisie van 2 cm gemaakt aan de achterste ruglijn. De incisie wordt gesloten met chirurgische clips, en de sponzen kunnen worden opgehaald op latere tijd punten voor cel-en vloeistofisolatie. Het cellulaire en cytokine-milieu van geïsoleerde sponzen weerspiegelt de normale stadia van acute wondgenezing tot ongeveer 14 dagen na implantatie. Op latere tijdpunten is het model voordeliger voor het bestuderen van granulatieweefselvorming en de vreemde lichaamsrespons¹. Met dit systeem is het mogelijk om >10⁶ cellen te isoleren, wat een duidelijk voordeel biedt voor fenotypische en functionele testen en RNA-isolatie, over het isoleren van cellen van andere biopsie-gebaseerde methoden^{1,22,23,25,26}.

De snelheid van wondsluiting wordt bepaald met behulp van het staarthuidexcisiemodel. In dit model, zoals in eerste instantie beschreven door Falanga et al. en gemeld door anderen^27,28,29,30, een 1 cm x 0,3 cm volledige dikte sectie van de staart huid wordt verwijderd in de buurt van de basis van de staart. Het wondgebied wordt gemakkelijk gevisualiseerd en kan na verloop van tijd worden gemeten. Als alternatief kan staartweefsel worden geïsoleerd voor histologische analyse. Deze aanpak kan worden gebruikt als een alternatief voor of in combinatie met de gevestigde dorsale punch biopsie methode. Het primaire onderscheid tussen deze twee modellen zijn de snelheid van wondsluiting, de aan- of afwezigheid van bont en de huidstructuur^2,31,32. Staarthuidwonden bieden een langer tijdsbestek om de wondsluiting te beoordelen, omdat het ongeveer 21 dagen duurt voordat de volledige sluiting optreedt. Dit is in tegenstelling tot ongespkal dorsale punch biopten, die veel sneller genezen (~ 7-10 dagen), voornamelijk door contractie als gevolg van de werking van de panniculus carnosus. Spalkd rugstompbiopten genezen langzamer en verminderen de effecten van contractiele genezing, maar vertrouwen op de aanwezigheid van een vreemd lichaam om contractiele mechanismen te beperken^{1,2,27,30,31,33}.

De beschreven wondmodellen zijn informatief voor het begrijpen van normale wondgenezingsprocessen bij afwezigheid van verstoring. Terwijl de genezing van knaagdierhuid op zeer significante manieren verschilt van de menselijke huid, waaronder losse structuur, afhankelijkheid van contractiele genezing en andere anatomische verschillen, biedt het murinesysteem bepaalde voordelen voor mechanistische en screeningsstudies. Belangrijkste onder deze is de beschikbaarheid van inteelt stammen en genetische mutanten, genetische traktaat, en lagere kosten. Mechanistisch inzicht dat is opgedaan met murinestudies kan worden vertaald naar complexe diermodellen die de genezing van de menselijke huid, zoals het varkenssysteem²,^,31,beter nabootsen.

Naast het onderzoeken van wondgenezingsreacties in de steady state, kunnen deze modellen worden gecombineerd met comorbide aandoeningen om de basis van wondgenezingsdefecten op cellulair, cytokine en brutoweefselniveau te begrijpen. Het is in deze specifieke setting dat de twee modellen in overleg kunnen worden gebruikt om de effecten van een bepaalde comorbide aandoening, zoals postoperatieve longontsteking, te beoordelen op zowel de acute cellulaire wondgenezingsrespons als de snelheid van wondsluiting³⁰.

Protocol

Alle hier beschreven dierstudies zijn goedgekeurd door het Institute Of The Brown University Institutional Animal Care and Use Committee en uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van dieren van de National Institutes of Health.  LET OP: in de video is het chirurgische gordijn weggelaten voor demonstratiedoeleinden. 1. Onderhuidse implantatie van PVA-sponzen Gebruik een schaar om vellen PVA-spons in stukken van 8 mm x 8 mm x 4 mm te snijden. Rehyd…

Representative Results

Systemische ontstekingsreactie na PVA sponsimplantatieDe PVA spons implantatie operatie genereerde een systemische ontstekingsreactie, zoals blijkt uit de inductie van IL-6 in het plasma 1 dag na het verwonden (Figuur 2A). Andere ontstekingscytokinen, waaronder TNF-α en IL-1β, evenals een reeks chemokines, waaronder CCL2 en CXCL1, werden systemisch geïnduceerd in de eerste 7 dagen na de sponsimplantatie na PVA, en zijn elders beschreven26,…

Discussion

Dit artikel beschrijft twee hardnekkige murine wond modellen die het mogelijk maken voor de beoordeling van de acute wondgenezing reactie. De eerste methode omvat de chirurgische implantatie van PVA sponzen in de dorsale onderhuidse ruimte. Deze aanpak biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van biopsie-gebaseerde wondmodellen voor het bestuderen van de cellulaire wondgenezingsrespons vanwege het grote aantal cellen en de hoeveelheid wondvloeistoffen verkregen uit de geïsoleerde sponzen. Voor de succesvolle uitvoering…

Materials

10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus	Genesee	28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red)	ThermoFisher Scientific	14025076
5ml Syringe	BD	309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750	BioLegend	109852	Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660	ThermoFisher Scientific	50-4801-82	Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC	BD Biosciences	553104	Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710	ThermoFisher Scientific	46-9668-82	Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700	BD Biosciences	565183	Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier	Braintree Scientific	NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm	Braintree Scientific	NC9334081
Blender Bag, 80mL	Fisher Scientific	14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100	Genesee Scientific	21-130
Fetal Bovine Serum – Standard	ThermoFisher Scientific	10437028
Fixable Viability Dye eFluor506	ThermoFisher Scientific	65-0866-14
Hepes Solution, 1M	Genesee Scientific	25-534
ImageJ Software	NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size	Ivalon/PVA Unlimited		www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10%	Fisher Scientific	3955-16
Spray barrier film, Cavilon	3M	3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V	Seward	0080/000/AJ