Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.
Summary
Burada, biri hücresel ve sitokin yara iyileştirici yanıtlarını değerlendirmek, diğeri ise yara kapatma oranını ölçmek için tasarlanmış iki murine yara iyileşmesi modeli tanımlanmıştır. Bu yöntemler, kötü yara iyileşmesiçeşitli yönlerini mekanizmaları belirlemek için diyabet gibi karmaşık hastalık modelleri ile kullanılabilir.
Abstract
Yara iyileşmesi inflamasyon, granülasyon doku oluşumu, fibrozis ve çözünürlük düzenli ilerlemesini gerektiren karmaşık bir süreçtir. Murine modelleri bu süreçlere değerli mekanistik bilgiler sağlar; ancak, tek bir model tamamen yara iyileşme yanıtı tüm yönleriyle adresleri. Bunun yerine, yara iyileşmesi farklı yönlerini ele almak için birden fazla model kullanmak idealdir. Burada yara iyileşmesi yanıtının farklı yönlerini ele alan iki farklı yöntem tanımlanmıştır. İlk modelde polivinil alkol süngerleri fare dorsum boyunca deri altı implante edilir. Sünger alımının ardından hücreler mekanik bozulma ile izole edilebilir ve sıvılar santrifüj ile çıkarılabilir, böylece akut yara ortamında hücresel ve sitokin yanıtlarının ayrıntılı bir karakterizasyonuna olanak sağlar. Bu modelin bir sınırlama yara kapatma oranını değerlendirmek için yetersizlik tir. Bunun için kuyruk derisi eksizyonu modeli kullanılmaktadır. Bu modelde, kuyruk derisinin 10 mm x 3 mm dikdörtgen parçası, kuyruk tabanına yakın, sırt yüzeyi boyunca çıkar. Bu model kolayca iyileşme oranlarını belirlemek için planimetrik analiz için fotoğraflanabilir ve histolojik analiz için excised olabilir. Tanımlanan her iki yöntem de genetik olarak değiştirilmiş fare suşlarında veya yara iyileşme mekanizmalarını açıklamak için diyabet, yaşlanma veya sekonder enfeksiyon gibi komorbid durum modelleri ile birlikte kullanılabilir.
Introduction
Yara iyileşme süreçlerini incelemek için birçok murine model sistemleri vardır, her biri belirli avantajları ve sınırlamaları sahip1,2. Aşağıdaki yöntemler, her biri yara iyileşmesi yanıtının belirli bir yönünü ele alan ve yaralanmaya yanıttaki tedirginliklerin neden ve etkisini belirlemek için kullanılabilen iki murine yara modeli sunar. Yara iyileşme süreci farklı evrelerde gerçekleşir. İlk aşama inflamatuardır, trombositlerin hızlı akını ile karakterize, nötrofiller, ve monositler / makrofajlar, yanı sıra proinflamatuar sitokinler ve kemokinler üretimi. İltihapın çözülmesinden sonra, profibrotik ve proanjiogenik sitokinlerin indüksiyonu ve büyüme faktörleri ile ortam daha iyi bir duruma geçmektedir. Granülasyon dokusu birikir ve neokaplar miyofibroblastlar, fibroblastlar, epitel hücreleri ve endotel hücrelerinin göçü ile oluşur. Son aşamalarda, geçici hücre dışı matriks remodeled ve yara oluşumu ve yara kapatma gelirleri2,3,4,5,6,7,8.
Hiçbir tek murine modeli yara iyileşmesi tüm aşamalarında çalışmak için bir sistem sağlar2. Burada iki cerrahi yara modeli tanımlanmıştır: biri akut hücresel ve sitokin yara iyileşme yanıtlarını açıklığa kavuştururken, diğeri yara kapanmasının değerlendirilmesinin yanı sıra histolojik analizlere de olanak sağlar. Bu iki yöntem, yara iyileşmesi yanıtının farklı yönleri üzerinde bir tedirginlik veya komorbiditenin etkilerini değerlendirmek için tamamlayıcı bir şekilde kullanılabilir. Polivinil alkol (PVA) süngerlerin dorsal deri altıimplantasyonu,hücresel ve granülasyon doku yanıtlarının çeşitli yönlerini açıklamak için yıllardır kemirgen modellerinde kullanılan bir sistemdir 9 ,10,11,12,,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Bu yaklaşım sitokin açısından zengin yara sıvıları ve hücresel infiltrasyon ların alınmasını sağlar. Bu modelde, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA sünger parçaları posterior dorsal orta hatta yapılan 2 cm’lik bir kesi ile deri altı ceplere yerleştirilir. Kesi cerrahi klipslerle kapatılır ve süngerler hücre ve sıvı izolasyonu için daha sonraki zaman noktalarında alınabilir. İzole süngerlerin hücresel ve sitokin ortamı, yaklaşık 14 gün postimplantasyona kadar akut yara iyileşmesinin normal evrelerini yansıtır. Daha sonraki zaman noktalarında model granülasyon doku oluşumu ve yabancı cisim yanıtı1incelenmesi için daha avantajlıdır. Bu sistem ile fenotipik ve fonksiyonel tahliller ve RNA izolasyonu için ayrı bir avantaj sunan >106 hücreleri, diğer biyopsi tabanlı yöntemlerden hücreleri izole etme üzerinde1,22,2323,25,26izole etmek mümkündür.
Kuyruk derisi eksizyon modeli kullanılarak yara kapatma oranı belirlenir. Bu modelde, başlangıçta Falanga ve ark. tarafından açıklanan ve diğerleri tarafından bildirilen27,28,29,30, kuyruk derisinin 1 cm x 0.3 cm tam kalınlıkta bölümü kuyruk tabanına yakın kaldırılır. Yara alanı kolayca görselleştirilir ve zaman içinde ölçülebilir. Alternatif olarak, kuyruk dokusu histolojik analiz için izole edilebilir. Bu yaklaşım, köklü sırt yumruğu biyopsisi yöntemine alternatif olarak veya birlikte kullanılabilir. Bu iki model arasındaki birincil ayrımlar yara kapatma oranı, kürk varlığı veya yokluğu ve cilt yapısı2,31,32. Kuyruk deri yaraları, yara kapanmasını değerlendirmek için daha uzun bir zaman dilimi sunar, çünkü tam kapanmanın gerçekleşmesi yaklaşık 21 gün sürer. Bu çok daha hızlı iyileşmek için içler acıklı sırt yumruğu biyopsiler karşı, (~ 7-10 gün), öncelikle panniculus karnosus eylem nedeniyle kasılma ile. Splinted sırt yumruğu biyopsileri daha yavaş iyileşmek ve kontraktil iyileşme etkilerini azaltmak, ama kontraktil tabanlı mekanizmaları 1 kısıtlamak için yabancı bir cisim varlığı güveniyor1,2,27,,30,31,33.
Açıklanan yara modelleri, tedirginlik yokluğunda normal yara iyileşme süreçlerini anlamak için bilgilendiricidir. Kemirgen derisinin iyileşmesi gevşek yapısı, kontraktil iyileşmeye güven ve diğer anatomik farklılıklar da dahil olmak üzere insan derisinden çok önemli şekillerde farklılık gösterirken, minür sistemi mekanistik ve tarama çalışmaları için bazı avantajlar sunar. Bunların başında inbred suşları ve genetik mutantlar, genetik sistem ve düşük maliyet durumudur. Murine çalışmalarından elde edilen mekanistik içgörü, domuz sistemi2,31gibi insan deri iyileşmesini daha yakından taklit eden karmaşık hayvan modellerine çevrilebilir.
Sabit durumda yara iyileşmesi yanıtları incelenmesine ek olarak, bu modeller hücresel, sitokin ve brüt doku düzeyinde yara iyileşmesi kusurlarının temelini anlamak için komorbid koşulları ile kombine edilebilir. Bu iki model, ameliyat sonrası pnömoni gibi belirli bir komorbid durumun etkilerini değerlendirmek için birlikte kullanılabilir bu özel ayarı, hem akut hücresel yara iyileşme yanıtı ve yara kapatma oranı30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, akut yara iyileşmesi yanıtının değerlendirilmesini sağlayan iki çekilebilir murine yara modeli açıklanmaktadır. İlk yöntem dorsal deri altı alana PVA süngerlerin cerrahi implantasyonu içerir. Bu yaklaşım, izole süngerlerden elde edilen çok sayıda hücre ve yara sıvısı miktarı nedeniyle hücresel yara iyileşmesi yanıtını incelemek için biyopsi bazlı yara modellerine göre belirgin bir avantaj sağlar. Bu işlemin başarılı bir şekilde uygulanabı için, kesi çevresindeki deri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Kevin Carlson Brown Üniversitesi Akış Sitometri ve Sıralama Tesisi danışma ve akış sitometri deneyleri ile yardım için teşekkür etmek istiyorum. Şekil 1B ve C’deki görüntüler BioRender ile oluşturulmuştur. Kayla Lee ve Gregory Serpa fotoğrafyardım için teşekkür edilir. Bu çalışma aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir: Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Yeni Gelişen Yeni Bilim Ödülü Dekan Alanları (Brown Üniversitesi), Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Ulusal Çevre Bilimleri Enstitüsü (NIES) T32-ES7272 (Çevre Patolojisi Eğitimi) ve Brown Üniversitesi Araştırma Tohum Ödülü.
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
Riferimenti
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
- Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
- Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
- Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
- Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
- Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
- Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
- Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
- Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
- Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
- Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
- Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
- MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
- Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
- Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
- Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
- Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
- Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
- Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
- Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
- Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
- Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
- Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
- Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
- Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
- Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
- Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
- Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
- DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
- Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
- Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).
