Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer
Summary
En bekvem, hurtig og omkostningseffektiv metode til at måle andelen af sidepopulationceller i faste tumorcellelinjer præsenteres.
Abstract
Kræft stamceller (CSC’ er) er en vigtig årsag til tumor vækst, metastaser, og tilbagefald. Isolation og identifikation af CSC’er er af stor betydning for tumorforskning. I øjeblikket er flere teknikker, der anvendes til identifikation og rensning af CSC’er fra tumorvæv og tumor cellelinjer. Adskillelse og analyse af sidepopulationer (SP) celler er to af de almindeligt anvendte metoder. Metoderne er afhængige af CSC’ernes evne til hurtigt at udvise fluorescerende farvestoffer, såsom Hoechst 33342. Farvestoffets efflux er forbundet med de ATP-bindende kassettetransportører (ABC) og kan hæmmes af ABC-transporterhæmmere. Metoder til farvning af dyrkede tumorceller med Hoechst 33342 og analyse af andelen af deres SP-celler ved flowcytometry er beskrevet. Denne analyse er praktisk, hurtig og omkostningseffektiv. Data genereret i denne analyse kan bidrage til en bedre forståelse af effekten af gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler på tumorcellernes stængelegenskaber.
Introduction
Kræft stamceller (CSC’er) er delmængder af celler med selvfornyelse evne og flere differentiering potentiale, som spiller en afgørende rolle i tumor vækst, metastaser, og gentagelse1,2. I øjeblikket, CSC’er er blevet identificeret til at eksistere i en række ondartede tumorer, herunder lunge, hjerne, bugspytkirtel, prostata, bryst, og leverkræft3,4,5,6,7,8,9. Identifikation af CSC’er i disse tumorer er hovedsageligt baseret på tilstedeværelsen af overflademarkørproteiner, såsom højt og / eller lavt udtryk for CD44, CD24, CD133 og Sca-19,10, men en unik markør, der kan skelne CSC’er fra ikke-CSC’er, er ikke blevet rapporteret indtil videre. I øjeblikket er flere teknikker bruges til at identificere og rense CSC’er i tumorvæv eller tumor cellelinjer. Disse teknikker er designet ud fra CSC’ernes specifikke egenskaber. Blandt dem er assays og sortering af sidepopulation (SP) celler to af de almindeligt anvendte metoder.
SP celler blev oprindeligt opdaget af Goodell et al.11, når de karakteriserede hæmatopoietiske stamceller i mus knoglemarvsceller. Når musen knoglemarvsceller blev mærket med fluorescerende farvestof Hoechst 33342, en lille gruppe af Hoechst 33342 svagt farvede celler dukkede op i de to-dimensionelle prik plot af en flow cytometri assay. Hoechst 33342 er et DNA-bindende farvestof og har mindst to bindende tilstande, der fører til forskellige spektralegenskaber. Ved visning af fluorescensemission ved to bølgelængder på samme tid kan flere populationer afsløres12. I deres analyse, var Hoechst 33342 ophidset på 350 nm og fluorescens blev målt ved hjælp af 450/20 nm band-pass (BP) filter og 675 nm kant filter long-pass (EFLP)11. Sammenlignet med hele populationen af knoglemarvsceller blev denne gruppe celler beriget med hæmatopoietiske stamceller kaldet SP-celler11. SP celler er i stand til hurtigt at udvise Hoechst 33342. Efflux af dette farvestof er relateret til ATP-bindende kassette (ABC) transportører13, som kan hæmmes af nogle stoffer som Fumitremorgin C14, Verapamil og Reserpine15,16. Derefter blev forskellige proportioner af SP-celler påvist i en række væv, organer, tumorvæv og tumorcellelinjer17,18,19. Disse SP-celler har mange karakteristika ved stamceller17,19.
Dette manuskript beskriver Hoechst 33342 mærkning og farvning af dyrkede tumorceller og analyse af SP-celler ved flowcytometry. Desuden er optimering af Hoechst 33342 koncentration og den korrekte blocker udvælgelse til en bestemt tumor celle linje ved hjælp af denne fremgangsmåde vist. Endelig er virkningerne af stemness fremme eller hæmning signaler på andelen af SP i tumorceller er påvist. De eksperimentelle eksempler viser, at analyse af SP kan bruges til at udforske virkningerne af forskellige signaler, såsom genekspression, små hæmmere, aktivatorer, cytokiner og kemokiner, på tumorstilke. Sammenlignet med andre metoder til isolering og rensning af CSC’er, såsom sortering af CD44+/ CD24– befolkning, aldehyd dehydrogenase (ALDH) analyse, og tumor kugle dannelse assays, denne metode er lettere for manipulation og er omkostningseffektiv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere vigtige punkter at huske på for SP assay. Den første er valget af en korrekt blokker, såsom Verapamil eller Reserpine, for hver cellelinje, fordi SP-cellernes “gate” placering bestemmes i henhold til den position, hvor et stort antal SP-celler forsvinder efter tilføjelsen af blokkeren. For MDA-MB-231 cellelinjen fungerer Reserpine godt. For andre cellelinjer kan forskellige blokkere dog fungere bedre.
Den anden er koncentrationen af Hoechst 33342. Procentdelen af SP-celler ste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 og 81972787; Naturvidenskab Stiftelsen af Tianjin City (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundforskningsfonde for de centrale universiteter, Nankai-universitetet 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
Riferimenti
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Ricerca sul cancro. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Ricerca sul cancro. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
