Une méthode pratique, rapide, et rentable pour mesurer la proportion de cellules de population latérale dans les variétés de cellule pleines de tumeur est présentée.
Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une cause importante de croissance, de métastase, et de répétition de tumeur. L’isolement et l’identification de CSCs sont d’une grande importance pour la recherche de tumeur. Actuellement, plusieurs techniques sont utilisées pour l’identification et la purification des CSC à partir de tissus tumoraux et de lignées cellulaires tumorales. La séparation et l’analyse des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées. Les méthodes reposent sur la capacité des CSC à expulser rapidement les colorants fluorescents, tels que Hoechst 33342. L’efflux du colorant est associé aux transporteurs de cassette de liaison à l’ATP (ABC) et peut être inhibé par des inhibiteurs du transporteur ABC. Des méthodes pour souter les cellules cultivées de tumeur avec Hoechst 33342 et analyser la proportion de leurs cellules de SP par cytometry d’écoulement sont décrites. Ce test est pratique, rapide et rentable. Les données générées dans ce test peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.
Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont des sous-ensembles de cellules ayant une capacité d’autore renouvellement et un potentiel de différenciation multiple, qui jouent un rôle essentiel dans la croissance tumorale, les métastases et la récurrence1,2. Actuellement, les CSC ont été identifiés comme existant dans une variété de tumeurs malignes, y compris les cancers du poumon, du cerveau, du pancréas, de la prostate, du sein et du foie3,4,5,6,7,8,9. L’identification de CSCs dans ces tumeurs est principalement basée sur la présence des protéines de marqueur de surface, telles que l’expression haute et/ou basse de CD44, CD24, CD133, etSca-1 9,10,mais un marqueur unique qui peut distinguer CSCs de non-CSCs n’a pas été rapporté jusqu’ici. Actuellement, plusieurs techniques sont employées pour identifier et purifier des CSC dans le tissu tumoral ou les variétés de cellule tumorales. Ces techniques sont conçues en fonction des propriétés spécifiques des CSC. Parmi eux, les tests et le tri des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées.
Les cellules SP ont été découvertes à l’origine par Goodell et al.11,lorsqu’ils ont caractérisé les cellules souches hématopoïétiques dans les cellules de la moelle osseuse de la souris. Quand les cellules de moelle de souris ont été étiquetées avec le colorant fluorescent Hoechst 33342, un petit groupe de cellules de Hoechst 33342 faiblement-souillées est apparu dans le diagramme bidimensionnel de point d’une analyse cytometry d’écoulement. Hoechst 33342 est un colorant liant l’ADN et a au moins deux modes de liaison qui conduisent à des caractéristiques spectrales différentes. Lors de la visualisation de l’émission de fluorescence à deux longueurs d’onde en même temps, plusieurs populations peuvent être révélées12. Dans leur test, le Hoechst 33342 a été excité à 350 nm et la fluorescence a été mesurée à l’aide du filtre passe-bande (BP) de 450/20 nm et du filtre de bord de 675 nm passe-long (EFLP)11. Par rapport à toute la population de cellules de moelle osseuse, ce groupe de cellules a été enrichi en cellules souches hématopoïétiques appelées cellules SP11. Les cellules SP sont capables d’expulser rapidement Hoechst 33342. L’efflux de ce colorant est apparenté aux transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC)13,qui peuvent être inhibés par certains agents tels que la fumitrémorgineC14,le vérapamil et la réserpine15,16. Après cela, différentes proportions de cellules SP ont été détectées dans une variété de tissus, d’organes, de tissus tumoraux et de lignées cellulairestumorales 17,18,19. Ces cellules SP présentent de nombreuses caractéristiques des cellules souches17,19.
Ce manuscrit décrit le étiquetage et la coloration de Hoechst 33342 des cellules tumorales cultivées et l’analyse des cellules SP par cytométrie en flux. D’ailleurs, l’optimisation de la concentration de Hoechst 33342 et la sélection appropriée de bloqueur pour une variété de cellule spécifique de tumeur utilisant cette approche sont montrées. Enfin, les effets des signaux de promotion ou d’inhibition de stemness sur la proportion de SP dans les cellules tumorales sont démontrés. Les exemples expérimentaux démontrent que l’analyse du SP peut être employée pour explorer les effets de divers signaux, tels que l’expression de gène, les petits inhibiteurs, les activateurs, les cytokines, et les chemokines, sur le stemness de tumeur. Par rapport à d’autres méthodes d’isolement et de purification des CSC, telles que le tri de cd44+/CD24– population, l’analyse de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et les tests de formation de sphère tumorale, cette méthode est plus facile à manipuler et est rentable.
Il y a plusieurs points clés à garder à l’esprit pour le test SP. Le premier est la sélection d’un bloqueur approprié, tel que Vérapamil ou Réserpine, pour chaque lignée cellulaire, car l’emplacement « porte » des cellules SP est déterminé en fonction de la position à laquelle un grand nombre de cellules SP disparaissent après l’ajout du bloqueur. Pour la lignée cellulaire MDA-MB-231, Reserpine fonctionne bien. Cependant, pour d’autres lignées cellulaires, différents bloqueurs peuvent mieux f…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par la Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 et 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Université de Nankai 63191153.
6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |