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Ricerca sul cancro

固形腫瘍細胞株における側集団の解析

Published: February 23, 2021
doi:
10.3791/60658
, , , ,
1School of Medicine,Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy,Nankai University

Summary

固体腫瘍細胞株における側集団細胞の割合を測定する便利で迅速かつ費用対効果の高い方法が提示される。

Abstract

がん幹細胞(CSC)は、腫瘍の増殖、転移、再発の重要な原因です。CSCの単離と同定は、腫瘍研究にとって非常に重要です。現在、腫瘍組織および腫瘍細胞株からのCSCの同定と精製にはいくつかの技術が用いられている。側母集団(SP)細胞の分離および分析は、一般的に使用される方法の2つである。これらの方法は、Hoechst 33342のような蛍光色素を迅速に排出するCSCの能力に依存します。色素の流出は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターに関連付けられており、ABCトランスポーター阻害剤によって阻害され得る。Hoechst 33342で培養腫瘍細胞を染色し、フローサイトメトリーによってそれらのSP細胞の割合を分析する方法が記載されている。このアッセイは、便利で、高速で、費用対効果が高い。このアッセイで生成されたデータは、腫瘍細胞の幹細胞性に対する遺伝子または他の細胞外および細胞内シグナルの影響をよりよく理解するのに役立つ。

Introduction

がん幹細胞(CSC)は、自己再生能および複数の分化能を有する細胞のサブセットであり、腫瘍の増殖、転移、再発1、2において重要な役割を果たす。現在、CSCは、肺、脳、膵臓、前立腺、乳房、および肝臓癌3、4、5、6、7、8、9を含む様々な悪性腫瘍に存在することが確認されている。これらの腫瘍におけるCSCの同定は、主にCD44、CD24、CD133、およびSca-19、10の高低発現などの表面マーカータンパク質の存在に基づいているが、CSCと非CSCを区別できるユニークなマーカーは、これまで報告されていない。現在、腫瘍組織または腫瘍細胞株のCSCを同定し、精製するためにいくつかの技術が使用されている。これらの手法は、CSC の特定のプロパティに基づいて設計されています。中でも、アッセイおよびサイド集団(SP)細胞の並べ替えは、一般的に使用される方法の2つである。

SP細胞は、マウス骨髄細胞の造血幹細胞を特徴としたグッデルら11によって発見された。マウス骨髄細胞を蛍光色素Hoechst 33342で標識すると、フローサイトメトリーアッセイの2次元ドットプロットに、微暗い染色された細胞の小群が現れた。Hoechst 33342は、DNA結合色素であり、異なるスペクトル特性につながる少なくとも2つの結合モードを有する。2つの波長で蛍光発光を同時に見ると、複数の集団が12を明らかにすることができる。そのアッセイでは、Hoechst 33342は350nmで励起し、蛍光は450/20 nmバンドパス(BP)フィルタおよび675 nmエッジフィルタロングパス(EFLP)11を用いて測定した。骨髄細胞の全集団と比較して、このグループの細胞は、SP細胞11と呼ばれる造血幹細胞で濃縮された。SP細胞は、Hoechst 33342を迅速に排出することができる。この染料の流出は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーター13に関連しており、これはフミトレモルジンC14、ベラパミルおよびレセルピン15、16などの一部の薬剤によって阻害され得る。その後、様々な組織、臓器、腫瘍組織、および腫瘍細胞株17、18、19において異なる割合のSP細胞が検出された。これらのSP細胞は、幹細胞17,19の多くの特徴を有する。

本稿では、培養腫瘍細胞のHoechst 33342の標識と染色、およびフローサイトメトリーによるSP細胞の分析について説明する。また、このアプローチを用いて、特定の腫瘍細胞株に対するHoechst 33342濃度および適切なブロッカー選択の最適化が示される。最後に、腫瘍細胞におけるSPの割合に対するステム促進または阻害シグナルの効果が実証される。実験例では、SPの分析が、遺伝子発現、小インヒビター、活性化剤、サイトカイン、ケモカインなどの様々なシグナルが腫瘍の幹に及ぼす影響を探究できることを実証しています。CD44+ /CD24の選別、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)分析、腫瘍球形成アッセイなど、CSCの分離精製のための他の方法と比較すると、この方法は操作が容易で、費用対効果が高い。

Protocol

1. 細胞の調製 細胞の消化と中和 6ウェルプレート中の腫瘍細胞(MDA-MB-231細胞など)を種子化し、5%CO2を供給する37°Cインキュベーターで培養した。 その密度が約90%に達したときに細胞を収穫します。培養液を十分に吸引し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)の3mLで細胞2xを洗浄する。注:シグナル経路阻害剤(例えば、FRA1阻害剤)、または活性化因子(例えば、STAT3活性化剤)…

Representative Results

この方法に従って4つの実験的SP分析を行った。最初の1つでは、ヒト乳癌細胞株であるMDA-MB-231のSP細胞の割合を正常な条件下で検出した。細胞計数後、Hoechst 33342を1 x106細胞を含む1つのチューブに加えて、3μg/mLの最終濃度を測定した。レセルピンとHoechst 33342は、それぞれ40 μMおよび3 μg/mLの最終濃度に別のチューブに加えられた。PIを両管に加えた。FSC-A(X軸)対PI-A(Y軸)のドットプロッ?…

Discussion

SPアッセイには、いくつかの重要な点があります。1つ目は、細胞株ごとにベラパミルやレセルピンなどの適切なブロッカーの選択であり、SP細胞の「ゲート」位置は、ブロッカーの添加後に多数のSP細胞が消失する位置に応じて決定される。MDA-MB-231細胞株の場合、レセルピンはうまく機能します。ただし、他のセルラインでは、異なるブロッカーの方がうまく機能する場合があります。

<p …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国81572599、81773124、81972787の自然科学財団によって資金提供されました。天津市自然科学財団(中国) 19JCYBJC27300;天津人民病院・南海大学共同研究助成 2016rmnk005;南海大学中央大学基礎研究63191153

Materials

6 well cell culture plate CORNING 3516 9.5 cm2 (approx.)
Colivelin MCE HY-P1061A Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries (BIOIND) 04-001-1ACS
Flow cytometer BD Biosciences BD LSRFortessa
Flow cytometer software BD Biosciences FACSDiva
Flow cytometry analysis software BD Biosciences FlowJo
Hoechst33342 Sigma-Aldrich B2261 bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Polystyrene round bottom test tube CORNING 352054 12 x 75 mm, 5mL
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
Reserpine Sigma-Aldrich 83580 (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester
SKLB816 Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Verapamil hydrochloride Sigma-Aldrich V4629 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Dong, X., Wei, Y., Xu, T., Tan, X., Li, N. Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines. J. Vis. Exp. (168), e60658, doi:10.3791/60658 (2021).
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