Viene presentato un metodo conveniente, veloce ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide.
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Articolo metodologico
Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una causa importante di crescita tumorale, metastasi e recidiva. L'isolamento e l'identificazione dei CSC sono di grande importanza per la ricerca sul tumore. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per l'identificazione e la purificazione dei CSC dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. La separazione e l'analisi delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati. I metodi si basano sulla capacità dei CSC di espellere rapidamente coloranti fluorescenti, come hoechst 33342. L'efflux del colorante è associato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC) e può essere inibito dagli inibitori del trasportatore ABC. Vengono descritti i metodi per la colorazione delle cellule tumorali coltivate con Hoechst 33342 e l'analisi della proporzione delle loro cellule SP mediante citometria a flusso. Questo test è conveniente, veloce ed economico. I dati generati in questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.
Introduzione
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono sottoinsiemi di cellule con capacità di autorinnoto e potenziale di differenziazione multipla, che svolgono un ruolo vitale nella crescita tumorale, metastasi erecidiva 1,2. Attualmente, i CSC sono stati identificati per esistere in una varietà di tumori maligni, tra cui tumori polmonari, cerebrali, pancreas, prostata, seno e fegato3,4,5,6,7,8,9<....
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Protocollo
1. Preparazione cellulare
- Digestione cellulare e neutralizzazione
- Seminare cellule tumorali (come le cellule MDA-MB-231) in una piastra di 6 pozzi e culturerle in un incubatore a 37 °C fornito con 5% di CO2.
- Raccogli le cellule quando la loro densità raggiunge circa il 90%. Aspirare accuratamente il mezzo di coltura e lavare accuratamente le cellule 2x con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Per esaminare gli effetti degli inibitori della via di segnalazione (ad esempio, inibitore di FRA1) o attivatori (ad esempio, attivatore STAT3) sulle caratteristiche di staminali delle cellule tumorali, le cellule ....
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Risultati
Secondo questo metodo sono state eseguite quattro analisi sperimentali dell'SP. Nel primo, abbiamo rilevato la proporzione di cellule SP in MDA-MB-231, che è una linea cellulare per il cancro al seno umano tripla negativa, in condizioni normali. Dopo il conteggio delle cellule, hoechst 33342 è stato aggiunto in un tubo contenente 1 x10 6 celle ad una concentrazione finale di 3 μg/mL. Reserpina e Hoechst 33342 sono stati aggiunti ad un altro tubo a concentrazioni finali rispettivamente di 40 μM e 3 μg/mL. PI è .......
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Discussione
Ci sono diversi punti chiave da tenere a mente per il test SP. Il primo è la selezione di un blocco adeguato, come Verapamil o Reserpine, per ogni linea cellulare, perché la posizione "gate" delle celle SP è determinata in base alla posizione in cui un gran numero di cellule SP scompaiono dopo l'aggiunta del blocco. Per la linea di celle MDA-MB-231, Reserpine funziona bene. Tuttavia, per altre linee di celle, i blocchi diversi potrebbero funzionare meglio.
Il secondo è la concentrazione di Hoe.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 e 81972787; Fondazione di Scienze Naturali della Città di Tianjin (Cina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali, l'Università di Nankai 63191153.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti | CORNING | 3516 | 9,5 cm2 (circa) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Arg-Ser-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Siero fetale bovino (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Citometro a flusso | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Software per citometro a flusso | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Software per analisi per citometria a flusso | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 tricloridrato |
| Polistirene provetta a fondo tondo | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidio ioduro (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(dietilmetilammonio)propil]-6-fenilfenantridinio diioduro |
| Reserpina | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17&alfa;, 18β, 20&alfa;)-11,17-Dimetossi-18-[(3,4,5-trimetossibenzoil)ossi]yohimban-16-carbossilico estere |
| metilico SKLB816 | Fornito dal Dr. Shengyong Yang, Università | ||
| Tripsina-EDTA (0,25%), fenolo rosso | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil cloridrato | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimetossifeniletil)metilammino] cloridrato di -2-(3,4-dimetossifenil)-2-isopropilvaleronitrile |
Riferimenti
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al.
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Ristampe e permessi
