En bekväm, snabb och kostnadseffektiv metod för att mäta andelen sidopopulationsceller i solida tumör cellinjer presenteras.
Cancerstamceller (CSCs) är en viktig orsak till tumörtillväxt, metastasering och återkommande. Isolering och identifiering av CSCs är av stor betydelse för tumör forskning. För närvarande används flera tekniker för identifiering och rening av CSCs från tumör vävnader och tumör cellinjer. Separation och analys av sidopopulationsceller (SP) är två av de vanliga metoderna. Metoderna förlitar sig på CSC: s förmåga att snabbt utvisa fluorescerande färgämnen, såsom Hoechst 33342. Färgämnets utflöde är förknippat med ATP-bindande kassett (ABC) transportörer och kan hämmas av ABC transportörhämmare. Metoder för färgning odlade tumörceller med Hoechst 33342 och analysera andelen av deras SP celler genom flöde cytometri beskrivs. Denna analys är bekväm, snabb och kostnadseffektiv. Data som genereras i denna analys kan bidra till en bättre förståelse av effekten av gener eller andra extracellulära och intracellulära signaler på tumörcellernas stamegenskaper.
Cancerstamceller (CSCs) är delmängder av celler med självförnyelseförmåga och multipla differentieringspotential, som spelar en viktig roll i tumörtillväxt, metastasering och återkommande1,2. För närvarande har CSCs identifierats för att existera i en mängd maligna tumörer, inklusive lunga, hjärna, bukspottkörtel, prostata, bröstochlevercancer3,4,5,6,7,8,9. Identifiering av CSCs i dessa tumörer är huvudsakligen baserat på förekomsten av ytmarkörproteiner, såsom högt och/ eller lågt uttryck av CD44, CD24, CD133 och Sca-19,10, men en unik markör som kan skilja CSCs från icke-CSCs har hittills inte rapporterats. För närvarande används flera tekniker för att identifiera och rena CSCs i tumörvävnad eller tumör cellinjer. Dessa tekniker är utformade baserat på CSC:s specifika egenskaper. Bland dem är analyser och sortering av sidopopulationsceller (SP) två av de vanliga metoderna.
SP-celler upptäcktes ursprungligen av Goodell et al.11, när de karakteriserade hematopoetiska stamceller i musbenmärgsceller. När mus benmärg celler var märkta med fluorescerande färgämne Hoechst 33342, en liten grupp av Hoechst 33342 svagt färgade celler uppträdde i den tvådimensionella pricken plot av ett flöde cytometri analys. Hoechst 33342 är ett DNA-bindande färgämne och har minst två bindningslägen som leder till olika spektralegenskaper. När man tittar på fluorescensutsläpp vid två våglängder samtidigt kan flera populationer avslöjas12. I sin analys var Hoechst 33342 upphetsad på 350 nm och fluorescensen mättes med hjälp av filtret 450/20 nm bandpass (BP) och 675 nm kantfilter långpass (EFLP)11. Jämfört med hela populationen av benmärgsceller berikades denna grupp av celler med hematopoetiska stamceller som kallas SP-celler11. SP-celler kan snabbt utvisa Hoechst 33342. Utflödet av detta färgämne är relaterat till ATP-bindande kassett (ABC) transportörer13, som kan hämmas av vissa medel som Fumitremorgin C14,Verapamil och Reserpine15,16. Därefter upptäcktes olika proportioner av SP-celler i en mängd olika vävnader, organ, tumörvävnader och tumörcelllinjer17,18,19. Dessa SP-celler har många egenskaper hos stamceller17,19.
Detta manuskript beskriver Hoechst 33342 märkning och färgning av odlade tumörceller och analys av SP-celler genom flöde cytometri. Dessutom visas optimering av Hoechst 33342 koncentrationen och rätt blockerare urval för en specifik tumör cellinje med hjälp av detta tillvägagångssätt. Slutligen demonstreras effekterna av stamning marknadsföring eller hämning signaler på andelen SP i tumör celler. De experimentella exemplen visar att analys av SP kan användas för att utforska effekterna av olika signaler, såsom genuttryck, små hämmare, aktivatorer, cytokiner och kemokiner, på tumörstamhet. Jämfört med andra metoder för isolering och rening av CSCs, såsom sortering av CD44+/ CD24– population, aldehyd dehydrogenas (ALDH) analys och tumör sfärbildning analyser, är denna metod lättare för manipulation och är kostnadseffektiv.
Det finns flera viktiga punkter att tänka på för SP-analysen. Den första är valet av en riktig blockerare, till exempel Verapamil eller Reserpine, för varje cellinje, eftersom SP-cellernas “gate” -plats bestäms enligt den position där ett stort antal SP-celler försvinner efter tillsats av blockeraren. För MDA-MB-231-cellinjen fungerar Reserpine bra. Men för andra cellinjer kan olika blockerare fungera bättre.
Den andra är koncentrationen av Hoechst 33342. Andelen SP-celler ökade …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 och 81972787; Naturvetenskapliga stiftelsen i Tianjin City (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundforskningsfonder för de centrala universiteten, Nankai University 63191153.
6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |