Här presenterar vi den molekylära karakterisering av dystrofin 38 uttryck med sanger sekvensering, RT-PCR och västra blotting i den kliniska prövningen.
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en degenerativ muskelsjukdom som orsakar progressiv förlust av muskelmassa, vilket leder till för tidig död. Mutationerna orsakar ofta en förvrängd läsram och för tidigt stopp kodon, vilket resulterar i en nästan total brist på dystrofinprotein. Läsramen kan korrigeras med hjälp av antisense oligonukleotider (AONs) som inducerar exonhopping. Morfolino AON viltolarsen (kodnamn: NS-065/NCNP-01) har visats för att inducera exon 53 hoppa, återställa läsramen för patienter med exon 52 borttagningar. Vi administrerade nyligen NS-065/NCNP-01 intravenöst till DMD patienter i en undersökande utredare-inletts, första-i-människa-studie av NS-065/NCNP-01. I denna metoder artikeln presenterar vi den molekylära karakterisering av dystrofin uttryck med sanger sekvensering, RT-PCR och västra blotting i den kliniska prövningen. Karakterisering av dystrofin uttryck var grundläggande i studien för att visa effekten eftersom inga funktionella resultatet tester utfördes.
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en degenerativ muskelsjukdom som orsakar progressiv förlust av muskelmassa, andningssvikt, och kardiomyopati, och det leder till för tidig död1. Sjukdomen orsakas av en brist på den stora strukturella muskelprotein dystrophin2. Mutationer i DMD-genen på X-kromosomen är recessiva, och sjukdomen drabbar 1 i 3500-5000 nyfödda hanar3,4,5. Mutationerna är ofta stora strykningar i en hotspot region mellan exons 44 och 55 som leder till en förvrängd läsning ram och för tidigt stopp kodon, orsakar nonsens-medierad förfall och en nästan total brist på dystrofinprotein6,7,8. Läsramen kan korrigeras med hjälp av antisense oligonukleotider (AONs) som inducerar exon hoppa över och återställa läsramen, delvis återställa dystrofin uttryck och fördröja sjukdomsprogression9,10,11. Den morpholino AON eteplirsen, som nyligen godkändes av Federal Drug Agency (FDA), inducerar hoppa över exon 51 och kan återställa läsramen hos patienter med exon 52 borttagningar12,13. Emellertid återställer exon 53 hoppa över läsramen för patienter med exon 52 borttagningar, och det kan potentiellt behandla cirka 10% av DMD patienter14. Morpholino AON-läkemedlet NS-065/NCNP-01 har visat sig framkalla att exon 53 hoppar över i mänskliga celler, och vi nyligen administreras NS-065/NCNP-01 till DMD patienter i en fas 1 öppen dos-eskalering klinisk prövning (hädanefter, kallad “studien”) (registrerad som UMIN: 000010964 och ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Studien visade en dosberoende ökning av exon 53 hoppa baserat på RT-PCR och dystrofin proteinnivåer baserat på västra blotting, och inga allvarliga negativa läkemedelshändelser eller avhopp observerades14.
I alla kliniska prövningar är analysen av resultaten av största vikt. För DMD kliniska prövningar pågår fortfarande en debatt om den bästa metoden för att visa en behandlingsfördel. Kliniska tester som 6-minuters promenadtestet har vissa nackdelar. Molekylär karakterisering av dystrophin uttrycket kan utföras med hjälp av flera metoder, såsom RT-PCR, qPCR, digital-PCR, västra blotting och immunohistokemi. Omfattningen av protein uttryck restaurering som krävs för att förmedla en klinisk nytta är dock oklart. I denna metoder artikel beskriver vi i detalj de RT-PCR och västra blotting metoder som används för att bestämma exon hoppa över och proteinnivåer, respektive, i fas 1-studien av AON hoppa över drogen NS-065/NCNP-0114.
Kliniska prövningar av DMD har producerat både framgångar och misslyckanden under de senaste åren. Både RT-PCR och västra blotting är vanliga tekniker för att bedöma hoppa effektivitet som genereras av exon-hoppa föreningar administreras till patienterna. RT-PCR har dock rapporterats över-uppskatta hoppa effektivitet jämfört med digitala PCR15. Även om detta beror på ett antal skäl, är det främst orsakas av effektivare förstärkning av de mindre hoppade fragment under PCR cykler. Det verkar som RT-PCR används i denna kliniska prövning också genererat högre hoppa effektivitetsvinster jämfört med protein uttryck uppskattas av västra blotting. Enligt FDA, Detta är ett mer tillförlitligt sätt att kvantifiera dystrofin restaurering12. Därav, försiktighet bör iakttas vid tolkning av RT-PCR hoppa resultat; emellertid kan tar prov stilla jämföras. Prover som visar högre hoppa över effektivitetsvinster baserat på RT-PCR-resultat exhbit ofta högre proteinuttryck nivåer i västra blot analyser.
Eftersom alla patienter i DMD kliniska prövningar inte har samma raderingsmönster kan det vara svårt att utforma grundfärger och sonder som är tillräckligt specifika för att utföra digital eller qPCR på alla prover. Därför är RT-PCR fortfarande ett bra alternativ för en första bedömning av hoppa effektivitet. Innan den kliniska prövningen av NS-065/NCNP-01 påbörjades var det tråkigt att bedöma hoppa över effektivitet för varje patient in vitro eftersom antingen en muskel- eller hudbiopsi var obligatorisk för att generera patientspecifika myoblaster. Vi har dock nyligen publicerat en ny teknik för att generera patientspecifika MYOD1-konverterade, urin-härledda celler (UDI:er) som en ny DMD muskelcell modell16. Således krävs endast urin som samlats in från patienten för att generera myoblasterna, och inget invasivt förfarande är nödvändigt. Vi anser att denna metod kan användas för att skärmen olika AONs i patient-specifika celler. Vidare kan olika grund- och prober testas innan patienten påbörjar någon klinisk prövning. Detta kan underlätta användningen av qPCR eller digital PCR för exon hoppa mätning i DMD kliniska prövningar i framtiden.
För att utföra western blot analys i denna kliniska prövning, en enda antikropp mot dystrofin användes, och endast en hälsosam kontroll användes som ett referensprov. Därav validerades inte antikroppens specificitet på lämpligt sätt. Detta, tillsammans med det faktum att antikroppen bara erkänner C-terminal domänen av dystrofin, är en begränsning av protokollet. Mer hälsosamma kontroller och antikroppar riktade mot olika domäner av dystrofinmolekylen är tillrådligt i framtiden.
Här sammanfattade vi de protokoll som användes i den senaste förberedande undersökande undersökande-initierade, första-i-människa-prövning av NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 är potentiellt tillämpligt på 10,1% av patienterna med DMD.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Dr Takashi Saito, Dr Tetsuya Nagata, Herr Satoshi Masuda, och Dr Eri Takeshita för vetenskaplig diskussion.
100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
EzBlot | Atto | AE-1460 | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
SDS | Nacalai | 31606-75 | |
Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Urea | Nacalai | 35907-15 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |