Det nuværende manuskript beskriver, hvordan man isolerer hippocampus arterioler og kapillærer fra muse hjernen, og hvordan man presser dem til trykmyografi, immunofluorescens, biokemi og molekylære studier.
Fra subtile adfærdsmæssige ændringer til sen-fase demens, vaskulær kognitiv svækkelse typisk udvikler efter cerebral iskæmi. Slagtilfælde og hjertestop er bemærkelsesværdigt seksuelt dimorfe sygdomme, og begge inducere cerebral iskæmi. Men, fremskridt i forståelsen af vaskulær kognitiv svækkelse, og derefter udvikle kønsspecifikke behandlinger, har været delvist begrænset af udfordringer i at undersøge hjernen mikrocirkulationen fra musemodeller i funktionelle undersøgelser. Her præsenterer vi en tilgang til at undersøge kapillær-til-arteriole signalering i en ex vivo hippocampus kapillar-parenchymal arteriole (hicapa) forberedelse fra mus hjernen. Vi beskriver, hvordan man isolerer, kanyle og under tryk mikrocirkulationen for at måle arteriolær diameter som respons på kapillær stimulation. Vi viser, hvilke passende funktionelle Kontroller der kan bruges til at validere HiCaPA-præparatets integritet og vise typiske resultater, herunder test af kalium som et Neuro vaskulær koblingsmiddel og effekten af den nyligt karakteriserede inhibitor af Kir2 aktiv rektificerende kalium kanal familie, ML133. Desuden sammenligner vi svarene i præparater opnået fra mandlige og kvindelige mus. Selv om disse data afspejler funktionelle undersøgelser, kan vores tilgang også anvendes i molekylær biologi, immunokemi og Elektrofysiologi undersøgelser.
Den piale cirkulation på overfladen af hjernen har været genstand for megen undersøgelse, dels på grund af dens eksperimentelle tilgængelighed. Men topologi af den cerebrale Vaskulaturen skaber særskilte regioner. I modsætning til den robuste Pial netværk rig på anastomoser med betydelig kapacitet til at omdirigere blodgennemstrømningen, intracerebral parenkymal arterioler (pas) nuværende begrænset sikkerhedsstillelse, hver af dem perfusing en diskret volumen af nervevæv1,2. Dette skaber en flaskehals effekt på blodgennemstrømningen, som kombineret med unikke fysiologiske funktioner3,4,5,6,7,8, gør intracerebral arterioler et afgørende sted for cerebral blodgennemstrømning (CBF) regel9,10. På trods af de tekniske udfordringer, som er forbundet med isolation og annullering af pas, har det sidste årti oplevet en øget interesse for ex vivo -funktionelle undersøgelser med trykbeholdere11,12,13,14,15,16,17. En af grundene til denne øgede interesse er den betydelige forskningsindsats, der udføres på neurovaskulære kobling (NVC), mekanismen opretholde hjernen funktionelle hyperæmi18.
Regionalt kan CBF hurtigt stige efter lokal neurale aktivering19. De cellulære mekanismer og signalerings egenskaber, der styrer NVC, er ufuldstændigt forstået. Men vi identificerede en tidligere uventet rolle for hjernen kapillærer under NVC i sensing neurale aktivitet og omsætte det til et hyperpolariserende elektrisk signal til spile opstrøms arterioler20,21,22. Action potentialer23,24 og åbning af store-ledning ca2 +-aktiverede k+ (BK) kanaler på astrocytiske endfeet25,26 øge den interstitiel kalium ionkoncentration [K+]o, hvilket resulterer i aktivering af stærke indadgående ensretter k+ (Kir) kanaler i den vaskulære endotelum af kapillærer. Denne kanal er aktiveret af ekstern K+ , men også af hyperpolarisering selv. Ved at sprede sig gennem Gap-kryds, regenererer hyperpolariserende strøm i tilstødende kapillar endotelceller op til arterien, hvor det forårsager nekrotiske afslapning og CBF øger20,21. Studiet af denne mekanisme fik os til at udvikle et trykbærende kapillar-parenchymal arteriole (CaPA) præparat til måling af arteriolær diameter under kapillær stimulation med vasoaktive stoffer. CaPA-præparatet består af et cannuleret intracerebral arteriole segment med en intakt, nedstrøms kapillær forgreningen. Kapillar enderne komprimeres mod kammer glasbunden med en mikropipette, som tilstopper og stabiliserer hele vaskulære dannelsen20,21.
Vi har tidligere lavet instrumental innovationer af Imaging Capa præparater fra Mouse cortex20,21 og arterioler fra rat amygdala13 og hippocampus16,17. Som hippocampus Vaskulaturen modtager mere opmærksomhed på grund af dens modtagelighed for patologiske tilstande, her giver vi en trin-for-trin metode til CaPA forberedelse fra musen hippocampus (HiCaPA), der ikke kun kan anvendes i funktionelle NVC undersøgelser, men også i molekylær biologi, immunkemi, og Elektrofysiologi.
Det trykbærende hicapa (hippocampus kapillar-parenkymal arteriole), der er beskrevet i dette manuskript, er en udvidelse af vores veletablerede procedure til at isolere, under tryk og studere parenkymal arterioler29. Vi rapporterede for nylig, at KIR 2.1 kanaler i hjernen kapillar endotelceller Sense stigninger i [K+]o forbundet med neurale aktivering, og generere et stigende hyperpolariserende signal, der udvider upstream arterioler20. Afslører denn…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Jules Morin for indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet. Denne forskning blev finansieret af Awards fra CADASIL sammen har vi håbet non-profit organisation, Center for Women’s Health and Research, og NHLBI R01HL136636 (FD).
0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
NS309 | Tocris | 3895 | |
Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |