Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Préparation pour l'étude fonctionnelle
Summary
Le présent manuscrit détaille comment isoler les artérioles et les capillaires hippocampiques du cerveau de la souris et comment les pressuriser pour la myographie sous pression, l’immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.
Abstract
Des altérations comportementales subtiles à la démence de phase tardive, l’affaiblissement cognitif vasculaire se développe typiquement suivant l’ischémie cérébrale. L’aVC et l’arrêt cardiaque sont des maladies dimorphiques remarquablement sexuellement, et les deux induisent l’ischémie cérébrale. Cependant, les progrès dans la compréhension de l’affaiblissement cognitif vasculaire, et puis développant des traitements sex-spécifiques, ont été en partie limités par des défis en étudiant la microcirculation de cerveau des modèles de souris dans les études fonctionnelles. Ici, nous présentons une approche pour examiner la signalisation capillaire-à-arteriole dans un artériole capillaire-parenchymal ex vivo (HiCaPA) préparation du cerveau de souris. Nous décrivons comment isoler, canuler, et pressuriser la microcirculation pour mesurer le diamètre artériolaire en réponse à la stimulation capillaire. Nous montrons quels contrôles fonctionnels appropriés peuvent être utilisés pour valider l’intégrité de préparation HiCaPA et afficher des résultats typiques, y compris l’essai de potassium comme agent de couplage neurovasculaire et l’effet de l’inhibiteur récemment caractérisé de la famille de canaux de potassium rectifiant s’intériorisent Kir2, ML133. En outre, nous comparons les réponses dans les préparations obtenues des souris mâles et femelles. Bien que ces données reflètent des études fonctionnelles, notre approche peut également être utilisée dans les études de biologie moléculaire, d’immunochimie et d’électrophysiologie.
Introduction
La circulation piale à la surface du cerveau a fait l’objet de nombreuses études, en partie en raison de son accessibilité expérimentale. Cependant, la topologie de la vascularisation cérébrale crée des régions distinctes. Contrairement au solide réseau pial riche en anastomoses avec une capacité substantielle pour rediriger le flux sanguin, les artérioles parenchymales intracérébrales (PA) présentent un approvisionnement collatéral limité, chacun d’eux perfusant un volume discret de tissu nerveux1,2. Cela crée un effet de goulot d’étranglement sur le flux sanguin qui, combiné avec des caractéristiques physiologiques uniques3,4,5,6,7,8, fait artérioles intracérébrales un site crucial pour le flux sanguin cérébral (CBF) régulation9,10. Malgré les défis techniques inhérents à l’isolement et à l’annulation des AP, la dernière décennie a vu un intérêt accru pour les études fonctionnelles ex vivo à l’aide de navires pressurisés11,12,13,14,15,16,17. Une des raisons de cet intérêt accru est l’effort considérable de recherche mené sur le couplage neurovasculaire (NVC), le mécanisme soutenant l’hyperémie fonctionnelle de cerveau18.
À l’échelle régionale, le CBF peut augmenter rapidement après l’activation neuronale locale19. Les mécanismes cellulaires et les propriétés de signalisation contrôlant NVC sont incomplètement compris. Cependant, nous avons identifié un rôle précédemment imprévu pour les capillaires de cerveau pendant NVC en sensibilisant l’activité neurale et en la traduisant dans un signal électrique hyperpolarisant pour dilater les artérioles en amont20,21,22. Potentield d’action23,24 et l’ouverture des canaux de grande conductance Ca2-activéK(BK) sur les pieds d’extrémité astrocytiques25,26 augmentent la concentration interstitielle d’ions de potassium [K–]o, qui a comme conséquence l’activation des canaux intérieurs forts de rectifier K(Kir) dans l’endothelium vasculaire des capillaires. Ce canal est activé park externe mais aussi par hyperpolarisation elle-même. Se propageant à travers les jonctions d’écart, le courant hyperpolarisant se régénère alors dans les cellules endothéliales capillaires adjacentes jusqu’à l’artériole, où il provoque la relaxation de myocyte et l’augmentation de CBF20,21. L’étude de ce mécanisme nous a menés à développer une préparation pressurisée d’artériole capillaire-parenchymal (CaPA) pour mesurer le diamètre artériolar pendant la stimulation capillaire avec des agents vasoactifs. La préparation de CaPA est composée d’un segment d’artériole intracérébrale cannulated avec une ramification capillaire intacte et en aval. Les extrémités capillaires sont comprimées contre le fond de verre de la chambre par une micropipette, qui occludes et stabilise toute la formation vasculaire20,21.
Nous avons précédemment fait des innovations instrumentales en imagerie des préparations CaPA à partir du cortex de souris20,21 et les artérioles du rat amygdale13 et hippocampe16,17. Comme la vascularisation hippocampal reçoit plus d’attention en raison de sa susceptibilité aux conditions pathologiques, ici nous fournissons une méthode étape par étape pour la préparation de CaPA de l’hippocampe de souris (HiCaPA) qui peut non seulement être employée dans les études fonctionnelles de NVC mais également dans la biologie moléculaire, l’immunochimie, et l’électrophysiologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La préparation sous pression HiCaPA (artériole capillaire-parenchymale hippocampal) décrite dans le présent manuscrit est une extension de notre procédure bien établie pour isoler, pressuriser et étudier les artérioles parchymales29. Nous avons récemment rapporté que les canaux Kir2.1 dans les cellules endothéliales capillaires du cerveau sentent des augmentations dans [K‘] o associés à l’activation neurale, et génèrent un signal hyperpolarisant ascendant qui d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tient à remercier Jules Morin pour ses commentaires perspicaces sur le manuscrit. Cette recherche a été financée par des prix de l’organisme à but non lucratif CADASIL Together We Have Hope, du Center for Women’s Health and Research et du NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
Riferimenti
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
