Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie
Summary
Das vorliegende Manuskript beschreibt, wie Hippocampus-Arteriolen und Kapillaren aus dem Maushirn isoliert werden können und wie man sie für Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekulare Studien unter Druck setzt.
Abstract
Von subtilen Verhaltensänderungen bis hin zu Demenz im spätstadium entwickelt sich in der Regel eine vaskuläre kognitive Beeinträchtigung nach zerebraler Ischämie. Schlaganfall und Herzstillstand sind bemerkenswert geschlechtsdiamorphe Erkrankungen, und beide induzieren zerebrale Ischämie. Der Fortschritt beim Verständnis der vaskulären kognitiven Beeinträchtigung und der Entwicklung geschlechtsspezifischer Behandlungen wurde jedoch teilweise durch Herausforderungen bei der Untersuchung der Mikrozirkulation des Gehirns aus Mausmodellen in funktionellen Studien begrenzt. Hier stellen wir einen Ansatz zur Untersuchung der Kapillar-Arteriole-Signalisierung in einem ex vivo hippocampalen Kapillar-Parenchymal-Arteriole (HiCaPA)-Präparat vom Maushirn vor. Wir beschreiben, wie man die Mikrozirkulation isoliert, cannulate und unter Druck setzt, um den Arteriolardurchmesser als Reaktion auf die Kapillarstimulation zu messen. Wir zeigen, welche geeigneten funktionellen Kontrollen verwendet werden können, um die Integrität der HiCaPA-Präparation zu validieren und typische Ergebnisse anzuzeigen, einschließlich der Prüfung von Kalium als neurovaskulärem Kopplungsmittel und der Wirkung des kürzlich charakterisierten Inhibitors der Kir2-Inwärtsrektifigungs-Kaliumkanalfamilie ML133. Darüber hinaus vergleichen wir die Reaktionen in Präparaten von männlichen und weiblichen Mäusen. Während diese Daten funktionelle Untersuchungen widerspiegeln, kann unser Ansatz auch in molekularbiologischen, Immunchemie- und Elektrophysiologiestudien verwendet werden.
Introduction
Die piale Zirkulation auf der Oberfläche des Gehirns war Gegenstand vieler Untersuchungen, teilweise wegen seiner experimentellen Zugänglichkeit. Die Topologie der zerebralen Vaskulatur schafft jedoch unterschiedliche Regionen. Im Gegensatz zum robusten pialen Netzwerk reich an Anastomosen mit beträchtlicher Kapazität zur Umleitung des Blutflusses, die intrazerebralen parenchymalen Arteriolen (PAs) bieten eine begrenzte Kollateralversorgung, die jeweils ein diskretes Volumen an Nervengewebe1,2durchdringen. Dies erzeugt einen Engpass-Effekt auf den Blutfluss, die, kombiniert mit einzigartigen physiologischen Merkmalen3,4,5,6,7,8, macht intracerebral arterioles eine entscheidende Stelle für zerebrale Durchblutung (CBF) Regulierung9,10. Trotz der technischen Herausforderungen, die mit der Isolierung und Cannulation von PAs verbunden sind, hat das Interesse an ex vivo funktionellen Studien mit Druckgefäßen11,12,13,14,15,16,17zugenommen. Einer der Gründe für dieses erhöhte Interesse ist der beträchtliche Forschungsaufwand an neurovaskulärer Kopplung (NVC), dem Mechanismus zur Erhaltung der funktionellen Hyperämie des Gehirns18.
Regional kann CBF nach lokaler neuronaler Aktivierung schnell ansteigen19. Die zellulären Mechanismen und Signaleigenschaften, die NVC steuern, sind unvollständig verstanden. Wir identifizierten jedoch eine bisher unerwartete Rolle für die Hirnkapillaren während NVC bei der Erfassung der neuronalen Aktivität und der Übersetzung in ein hyperpolarisierendes elektrisches Signal zur Ausgliederung der vorgelagerten Arteriolen20,21,22. Aktionspotentiale23,24 und Öffnung von Großleitfähigkeit Ca2+-aktivierten K+ (BK) Kanälen auf den astrozytischen Endfüßen25,26 erhöhen die interstitielle Kaliumionenkonzentration [K+]o, was zur Aktivierung starker nachinnen gleichrichternder K+ (Kir) Kanäle im vaskulären Endothel von Kapillaren führt. Dieser Kanal wird durch externes K+, aber auch durch Hyperpolarisation selbst aktiviert. Der hyperpolarisierende Strom, der sich durch Spaltknoten ausbreitet, regeneriert sich dann in benachbarten Kapillaren-Endothelzellen bis zur Arteriole, wo er Myozytenentspannung und CBF-Erhöhung20,21verursacht. Die Untersuchung dieses Mechanismus führte uns dazu, ein unter Druck stehendes kapillar-parenchymale Arteriol (CaPA) Präparat zu entwickeln, um den arteriolaren Durchmesser während der Kapillarstimulation mit vasoaktiven Wirkstoffen zu messen. Das CaPA-Präparat besteht aus einem kanülierten intracereralen Arteriolsegment mit einer intakten, nachgeschalteten Kapillarverzweigung. Die Kapillarenden werden durch eine Mikropipette gegen den Kammerglasboden verdichtet, die die gesamte Gefäßbildung verdichtet und stabilisiert20,21.
Wir haben zuvor instrumentale Innovationen durch die Abbildung CaPA-Präpa-Präpa-Präpa-Präpaden aus dem Mauskortex20,21 und Arteriolen aus der Rattenamygdala13 und hippocampus16,17gemacht. Da die Hippocampus-Vaskulatur aufgrund ihrer Anfälligkeit für pathologische Bedingungen mehr Aufmerksamkeit erhält, bieten wir hier eine Schritt-für-Schritt-Methode zur CaPA-Vorbereitung aus dem Maus-Hippocampus (HiCaPA), die nicht nur in funktionellen NVC-Studien, sondern auch in der Molekularbiologie, Immunchemie und Elektrophysiologie eingesetzt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die unter Druck stehende HiCaPA (hippocampal kapillar-parenchymale Arteriole) Präparation, die in diesem Manuskript beschrieben wird, ist eine Erweiterung unseres etablierten Verfahrens zur Isolierung, Unterdruck bildung und Untersuchung von parenchymalen Arteriolen29. Wir berichteten vor kurzem, dass Kir2.1 Kanäle in Gehirnkapillaren Endothelzellen Wahrnehmen steigt in [K+]o mit neuronaler Aktivierung verbunden, und erzeugen ein aufsteigendes hyperpolarisierendes Signal, d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Jules Morin für die aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Forschung wurde durch Auszeichnungen der gemeinnützigen Organisation CADASIL Together We Have Hope, des Center for Women es Health and Research und des NHLBI R01HL136636 (FD) finanziert.
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
Riferimenti
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