Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי
Summary
כתב היד הנוכחי מפרט כיצד לבודד היפובין ונימים ממוח העכבר וכיצד ללחוץ אותם על מיגרפיה ללחץ, immunofluorescence ביוכימיה, מחקרים מולקולריים.
Abstract
מתוך שינויים התנהגותיים עדינים לדימנציה בשלב מאוחר, ליקוי קוגניטיבי כלי דם מתפתח בדרך כלל בעקבות איסכמיה מוחית. שבץ ודום לב הם מחלות מינית במידה ניכרת, ושניהם לגרום איסכמיה מוחית. עם זאת, ההתקדמות בהבנת ליקוי קוגניטיבי בכלי הדם, ולאחר מכן פיתוח טיפולים ספציפיים למין, כבר מוגבל בחלקו על ידי אתגרים בחקירת מיקרוסירקולציה המוח מדגמי העכבר במחקרים פונקציונליים. כאן, אנו מציגים גישה כדי לבחון את arteriole הקפילר בvivo לשעבר נימי-מarteriole (היקואפה) הכנה מהמוח של העכבר. אנו מתארים כיצד לבודד, צינורית, והלחץ על המיקרוסירקולציה כדי למדוד קוטר arteriolar בתגובה לגירוי נימי. אנו מראים אילו בקרות תפקודית מתאים ניתן להשתמש כדי לאמת את שלמות ההכנה של הסדר ולהציג תוצאות טיפוסיות, כולל בדיקת אשלגן כסוכן צימוד וסקולרית ואת ההשפעה של המעכב שאפיינו לאחרונה של Kir2 פנימה לתקן אשלגן משפחה הערוץ, ML133. יתרה מזאת, אנו נשווה את התגובות בהכנות שהתקבלו מעכברים זכרים ונקבות. בעוד שנתונים אלה משקפים חקירות פונקציונליות, ניתן להשתמש בגישה שלנו גם בביולוגיה מולקולרית, בכימיה חיסונית ובלימודי אלקטרופיזיולוגיה.
Introduction
המחזור הפיטו על פני המוח היה מושא למידה רבה, בחלקו בשל הנגישות הניסיונית שלה. עם זאת, הטופולוגיה של ואצלב המוח יוצרת אזורים נפרדים. בניגוד לרשת הפיטו האיתנה העשירה באנסטוסים עם יכולת משמעותית לניתוב מראש של זרימת הדם, הגרם מהקיצילות (PAs) מהווה אספקה מוגבלת, כל אחד מהם מקיים נפח בדיד של רקמת העצבים1,2. זה יוצר אפקט צוואר בקבוק על זרימת הדם אשר, בשילוב עם תכונות פיזיולוגיות ייחודיות3,4,5,6,7,8, עושה גרם העורקי אתר חיוני עבור זרימת דם מוחין (cbf) תקנה9,10. למרות האתגרים הטכניים הכרוכים בבידוד ובצינורית של PAs, העשור האחרון ראה עניין מוגבר במחקרים לשעבר vivo תפקודית באמצעות כלי הלחץ11,12,13,14,15,16,17. אחת הסיבות לעניין מוגבר זה הוא מאמץ מחקרי ניכר שנערך על הזיווגים נוירוכלי (NVC), המנגנון העומד בראש תפקודי המוח היפראתרמיה18.
מאכלים, CBF יכול להגדיל במהירות בעקבות ההפעלה העצבית המקומית19. המנגנונים הסלולריים ומאפייני האיתות השולטים ב-NVC מובנים לחלוטין. עם זאת, זיהינו תפקיד בלתי צפוי בעבר עבור נימי המוח במהלך nvc בפעילות העצבית הרגישה ומתרגמת אותו לאות חשמלי מהקיטוב כדי להתרחב במעלה עורקי הראש20,21,22. פוטנציאל פעולה23,24 ופתיחה של מוליכות גדולה Ca2 +-מופעל K+ (BK) ערוצים על endcytic לאורך25,26 להגדיל את הריכוז יון האשלגן ביניים [K+]o, אשר תוצאות ההפעלה של חזקה מיישר פנימה מיישרים K+ (קיר) ערוצים של כלי הדם של נימים. ערוץ זה מופעל על-ידי החיצוני K+ אבל גם על ידי hyperpolarization עצמו. מתפשטת באמצעות צמתים הפער, הזרם המיקטריזציה ואז מחדש את התאים הסמוכים של נימי-הדם לarteriole, שם הוא גורם להרפיה מיציט ו-cbf להגדיל20,21. המחקר של מנגנון זה הוביל אותנו לפתח בלחץ קפיצ-מarteriole (קאפה) הכנה למדוד את קוטר arteriolar במהלך גירוי נימי עם סוכני vasoactive. ההכנה של קאפה מורכבת מפלח גרם arteriole קאננולה עם שלמות, מרמידות נימי במורד הזרם. קצות נימי הם דחוסים על קרקעית הזכוכית הקאמרית על ידי מיקרופיפטה, הסגר ומייצב את כל היווצרות כלי הדם20,21.
בעבר עשינו חידושים אינסטרומנטליים על ידי הדמיה של קאפה ההכנות מקליפת העכבר20,21 והעורקי המוח מהאמיגדלה של החולדה13 והיפוקמפוס16,17. כמו ההיפוקמאז ואצלב מקבל יותר תשומת לב בשל הרגישות שלה לתנאים פתולוגיים, כאן אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד עבור הכנה קאפה מן ההיפוקמפוס העכבר (היקופה) כי לא ניתן להשתמש רק במחקרים NVC פונקציונלי אלא גם בביולוגיה מולקולרית, כימיה חיסונית, אלקטרופיזיולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת הטאפה בלחץ (arteriole) הכנה המתואר בכתב היד הנוכחי היא הרחבה של ההליך הוקמה היטב שלנו כדי לבודד, לחצים, וללמוד העורקי העורקים29. אנו דיווחו לאחרונה כי קיר 2.1 ערוצי המוח בתאי נימי מוחי התחושה מגדילה ב [K+]o הקשורים הפעלה עצבית, וליצור אות היפרקטליזציה עולה כי מרחיב במעל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לז מורין על הערות תובנה על כתב היד. מחקר זה מומן על ידי פרסים מ CADASIL יחד יש לנו תקווה ללא מטרות רווח, המרכז לבריאות נשים ומחקר, ו NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
Riferimenti
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
