पूर्व वीवो दबाव हिप्पोकैम्पल केशिका-Parenchymal Arteriole कार्यात्मक अध्ययन के लिए तैयारी
Summary
वर्तमान पांडुलिपि विवरण कैसे माउस मस्तिष्क से हिप्पोकैम्पस आर्टेरियोल्स और केशिकाओं को अलग करने के लिए और कैसे दबाव myography, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, जैव रसायन, और आणविक अध्ययन के लिए दबाव बनाने के लिए ।
Abstract
सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन से देर से चरण मनोभ्रंश के लिए, संवहनी संज्ञानात्मक हानि आम तौर पर मस्तिष्क इस्केमिया के बाद विकसित करता है । स्ट्रोक और हृदय की गिरफ्तारी उल्लेखनीय यौन मंदरोगहैं, और दोनों सेरेब्रल इस्केमिया को प्रेरित करते हैं। हालांकि, संवहनी संज्ञानात्मक हानि को समझने में प्रगति, और फिर सेक्स-विशिष्ट उपचार विकसित करना, कार्यात्मक अध्ययनों में माउस मॉडल से मस्तिष्क माइक्रोसर्कुलेशन की जांच करने में चुनौतियों से आंशिक रूप से सीमित रहा है। यहां, हम माउस मस्तिष्क से एक पूर्व वीवो हिप्पोकैम्पल केशिका-पैरान्चिमल आर्टेरियोल (HiCaPA) तैयारी में केशिका-टू-आर्टेरियोल सिग्नलिंग की जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। हम वर्णन कैसे अलग करने के लिए, cannulate, और केशिका उत्तेजना के जवाब में arteriolar व्यास को मापने के लिए माइक्रोसर्कुलेशन दबाव । हम दिखाते हैं कि HiCaPA तैयारी अखंडता को मान्य करने और विशिष्ट परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए किस उपयुक्त कार्यात्मक नियंत्रण का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें एक न्यूरोवैस्कुलर युग्मन एजेंट के रूप में पोटेशियम का परीक्षण करना और किर2 आवक के हाल ही में विशेषता अवरोधक के प्रभाव को प्रदर्शित करना शामिल है। इसके अलावा, हम पुरुष और महिला चूहों से प्राप्त तैयारियों में प्रतिक्रियाओं की तुलना करते हैं। हालांकि ये डेटा कार्यात्मक जांच को दर्शाते हैं, हमारे दृष्टिकोण का उपयोग आणविक जीव विज्ञान, इम्यूनोकेमिस्ट्री और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययनों में भी किया जा सकता है।
Introduction
मस्तिष्क की सतह पर पियाल परिसंचरण बहुत अध्ययन की वस्तु रही है, आंशिक रूप से इसकी प्रायोगिक पहुंच के कारण। हालांकि, सेरेब्रल वैस्कुलचर की टोपोलॉजी अलग क्षेत्र बनाती है। रक्त प्रवाह को पुनः निर्देशित करने के लिए पर्याप्त क्षमता के साथ एनास्टोमूसा में समृद्ध मजबूत पियाल नेटवर्क के विपरीत, इंट्रासेरेब्रल पैरान्चिमल आर्टेरियोल्स (पीए) सीमित संपाश्र्वक आपूर्ति करते हैं, उनमें से प्रत्येक तंत्रिका ऊतक1,2की एक असतत मात्रा को व्याप्त करता है। यह रक्त प्रवाह पर एक अड़चन प्रभाव पैदा करता है, जो अद्वितीय शारीरिक विशेषताओंकेसाथ संयुक्त3,4,5,6,7,8,इंट्रारेब्रल आर्टेरियोल्स को मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) विनियमन9,10के लिए एक महत्वपूर्ण साइट बनाता है। पीए के अलगाव और कैनुलेशन के लिए निहित तकनीकी चुनौतियों के बावजूद, पिछले दशक में दबाव वाले जहाजों11,12 ,13,14,15,16,17का उपयोग करके पूर्व वीवो कार्यात्मक अध्ययनों में रुचि बढ़ी है । इस बढ़ी हुई रुचि का एक कारण न्यूरोवैस्कुलर युग्मन (एनवीसी) पर किया गया काफी शोध प्रयास है, जो मस्तिष्क कार्यात्मक हाइपरमिया18को बनाए रखने वाला तंत्र है।
क्षेत्रीय रूप से, सीबीएफ स्थानीय तंत्रिका सक्रियण19के बाद तेजी से बढ़ सकता है। एनवीसी को नियंत्रित करने वाले सेलुलर तंत्र और सिग्नलिंग गुणों को अधूरा समझा जाता है। हालांकि, हमने तंत्रिका गतिविधि को भांपते हुए एनवीसी के दौरान मस्तिष्क केशिकाओं के लिए पहले से अप्रत्याशित भूमिका की पहचान की और इसे अपस्ट्रीम आर्टेरियोल्स20,21,22को फैलाने के लिए हाइपरपोलार्फायरिंग इलेक्ट्रिकल सिग्नल में अनुवाद किया। कार्रवाई क्षमता23,24 और एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट25,26 पर बड़े संचालन सीए2 +-सक्रिय कश्मीर+ (बीके) चैनलों के उद्घाटन के लिए मध्यवर्ती पोटेशियम आयन एकाग्रता [कश्मीर+]ओ,जो मजबूत आवक सुधारक कश्मीर+ (कीर) चैनलों के सक्रियण में परिणाम कैपिलर के संवहनी एंडोथेलियम में वृद्धि । यह चैनल बाहरी K + द्वारा सक्रियहै, लेकिन यह भी हाइपरपोलीकरण से ही है। गैप जंक्शनों के माध्यम से फैलते हुए, हाइपरपोलाइज़िंग वर्तमान फिर आर्टेरियोल तक आसन्न केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं में पुनर्जीवित होता है, जहां यह मायोसाइट छूट का कारण बनता है और सीबीएफ20,21में वृद्धि करता है। इस तंत्र के अध्ययन ने हमें वासोएक्टिव एजेंटों के साथ केशिका उत्तेजना के दौरान आर्टेरियोलर व्यास को मापने के लिए एक दबाव वाले केशिका-पैरान्चिमल आर्टेरियोल (सीएपीए) तैयारी विकसित करने के लिए प्रेरित किया। CaPA तैयारी एक अक्षुण्ण, डाउनस्ट्रीम केशिका असर के साथ एक cannulated इंट्रासेरेब्रल आर्टिकुल खंड से बना है । केशिका सिरों को एक माइक्रोपाइपेट द्वारा कक्ष ग्लास बॉटम के खिलाफ संकुचित किया जाता है, जो पूरे संवहनी गठन20,21को रोकता है और स्थिर करता है।
हमने पहले माउस कॉर्टेक्स20,21 और रैट एमिग्डाला 13 और हिप्पोकैम्पस16 ,17से आर्टेरियोल्स से सीएपीए की तैयारी की इमेजिंग करके महत्वपूर्ण नवाचार किए । चूंकि हिप्पोकैम्पल वास्कुल्चर रोग की स्थिति के प्रति अपनी संवेदनशीलता के कारण अधिक ध्यान प्राप्त करता है, यहां हम माउस हिप्पोकैम्पस (HiCaPA) से CaPA तैयारी के लिए एक कदम-दर-कदम विधि प्रदान करते हैं जिसका उपयोग न केवल कार्यात्मक एनवीसी अध्ययन में बल्कि आणविक जीव विज्ञान, इम्यूनोकेमिस्ट्री और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित दबाव हिकापा (हिप्पोकैम्पल केशिका-पैरान्चिमल आर्टेरियोल) तैयारी हमारी सुस्थापित प्रक्रिया का एक विस्तार है जो पैरान्चिमल आर्टेरियोल्स29को अलग-थलग करने, दबाव और …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए जुल्स मोइन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस शोध को CADASIL से पुरस्कारों द्वारा वित्त पोषित किया गया था एक साथ हम आशा है कि गैर लाभ संगठन, महिला ओं के स्वास्थ्य और अनुसंधान के लिए केंद्र है, और NHLBI R01HL136636 (एफडी) ।
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
Riferimenti
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