Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional
Summary
El presente manuscrito detalla cómo aislar las arterias y capilares del hipocampo del cerebro del ratón y cómo presurizarlas para miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.
Abstract
Desde alteraciones conductuales sutiles hasta demencia en etapa sorpresa, el deterioro cognitivo vascular generalmente se desarrolla después de la isquemia cerebral. El accidente cerebrovascular y el paro cardíaco son enfermedades notablemente dimórficas sexualmente, y ambas inducen isquemia cerebral. Sin embargo, el progreso en la comprensión del deterioro cognitivo vascular, y luego el desarrollo de tratamientos específicos del sexo, se ha visto en parte limitado por los desafíos en la investigación de la microcirculación cerebral de los modelos de ratón en estudios funcionales. Aquí, presentamos un enfoque para examinar la señalización capilar-a-arteriola en una preparación ex vivo del arteriolo capilar-parenquimal del hipocampo (HiCaPA) del cerebro del ratón. Describimos cómo aislar, canalizar y presurizar la microcirculación para medir el diámetro arteriolar en respuesta a la estimulación capilar. Mostramos qué controles funcionales apropiados se pueden utilizar para validar la integridad de la preparación hiCaPA y mostrar resultados típicos, incluyendo la prueba de potasio como un agente de acoplamiento neurovascular y el efecto del inhibidor recientemente caracterizado de la familia de canales de potasio de retificación interna Kir2, ML133. Además, comparamos las respuestas en los preparados obtenidos de ratones machos y hembras. Si bien estos datos reflejan investigaciones funcionales, nuestro enfoque también se puede utilizar en estudios de biología molecular, inmunoquímica y electrofisiología.
Introduction
La circulación pial en la superficie del cerebro ha sido objeto de mucho estudio, en parte debido a su accesibilidad experimental. Sin embargo, la topología de la vasculatura cerebral crea regiones distintas. A diferencia de la robusta red pial rica en anastomosas con capacidad sustancial para redirigir el flujo sanguíneo, las arteriolas parénquimas intracerebrales (PA) presentan un suministro colateral limitado, cada uno de ellos perdiendo un volumen discreto de tejido nervioso1,2. Esto crea un efecto cuello de botella en el flujo sanguíneo que, combinado con características fisiológicas únicas3,4,5,6,7,8, hace que las arterias intracerebrales un sitio crucial para la regulación del flujo sanguíneo cerebral (CBF)9,10. A pesar de los desafíos técnicos inherentes al aislamiento y la cannulación de los PA, en la última década se ha visto un mayor interés en los estudios funcionales ex vivo utilizando recipientes presurizados11,12,13,14,15,16,17. Una de las razones de este mayor interés es el considerable esfuerzo de investigación realizado en el acoplamiento neurovascular (NVC), el mecanismo que sostiene la hiperemia funcional cerebral18.
Regionalmente, CBF puede aumentar rápidamente después de la activación neuronal local19. Los mecanismos celulares y las propiedades de señalización que controlan NVC se entienden incompletamente. Sin embargo, identificamos un papel previamente imprevisto para los capilares cerebrales durante la nCV en la observación de la actividad neuronal y traduciéndolo en una señal eléctrica hiperpolarizadora para dilatar las arterias aguas arriba20,21,22. Potenciales de acción23,24 y apertura de canales de gran conducta ca2+-activados K+ (BK) en los pies de extremo astrocíticos25,26 aumentan la concentración de iones de potasio intersticial [K+] o ,loque resulta en la activación de fuertes canales rectificadores internos K+ (Kir) en el endotelio vascular de los capilares. Este canal es activado por K+ externo, pero también por hiperpolarización en sí. La corriente hiperpolarizante se regenera en las células endoteliales capilares adyacentes hasta la arteriola, donde provoca relajación de los miocitos y aumento de la CBF20,21. El estudio de este mecanismo nos llevó a desarrollar una preparación capilar-parénquimal presurizada (CaPA) para medir el diámetro arteriolar durante la estimulación capilar con agentes vasoactivos. La preparación de CaPA se compone de un segmento de arteriolas intracerebrales canulados con una ramificación capilar intacta y aguas abajo. Los extremos capilares se comprimen contra el fondo del cristal de la cámara mediante un micropipeta, que ocluye y estabilice toda la formación vascular20,21.
Anteriormente realizamos innovaciones instrumentales mediante la toma de imágenes de los preparativos de CaPA a partir de la corteza del ratón20,21 y arterioles de la amígdala de rata13 y el hipocampo16,17. A medida que la vasculatura del hipocampo recibe más atención debido a su susceptibilidad a las condiciones patológicas, aquí proporcionamos un método paso a paso para la preparación de CaPA desde el hipocampo de ratón (HiCaPA) que no sólo se puede utilizar en estudios funcionales de NVC, sino también en biología molecular, inmunoquímica y electrofisiología.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación presurizada HiCaPA (arteriola capilar-parénquimal del hipocampo) descrita en el presente manuscrito es una extensión de nuestro procedimiento bien establecido para aislar, presurizar y estudiar arteriolas parénquimas29. Recientemente informamos que los canales Kir2.1 en las células endoteliales capilares cerebrales detectan aumentos en [K+]o asociados con la activación neuronal, y generan una señal de hiperpolarización ascendente que dilata los arteriol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Jules Morin por comentarios perspicaces sobre el manuscrito. Esta investigación fue financiada por premios de la organización sin fines de lucro CADASIL Together We Have Hope, el Center for Women’s Health and Research y el NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
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