CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler

Summary

Detta protokoll beskriver cryoAPEX-metoden, där ett APEX2-märkt membranprotein kan lokaliseras genom överföring elektronmikroskopi inom optimalt bevarad cellultrastruktur.

Abstract

Viktiga cellulära händelser som signaltransduktion och membranhandel är beroende av korrekt proteinplats i cellulära fack. Att förstå exakt subcellulära lokalisering av proteiner är därför viktigt för att svara på många biologiska frågor. Strävan efter en robust etikett för att identifiera proteinlokalisering i kombination med adekvat cellulär bevarande och färgning har historiskt utmanande. De senaste framstegen inom elektronmikroskopi (EM) bildbehandling har lett till utveckling av många metoder och strategier för att öka cellulära bevarande och etikett målproteiner. En relativt ny peroxidasbaserad genetisk tagg, APEX2, är en lovande ledare inom klonbara EM-aktiva taggar. Provberedning för transmissionelektronmikroskopi (TEM) har också avancerat under de senaste åren med tillkomsten av cryofixation genom högtrycksfrysning (HPF) och lågtemperaturuttorkning och färgning via frysningsubstitution (FS). HPF och FS ger utmärkt bevarande av cellulär ultrastruktur för TEM-avbildning, näst efter direkt kryo-imaging av glaskroppen prover. Här presenterar vi ett protokoll för cryoAPEX-metoden, som kombinerar användningen av APEX2-taggen med HPF och FS. I detta protokoll är ett protein av intresse märkt med APEX2, följt av kemisk fixering och peroxidasreaktion. I stället för traditionell färgning och alkoholuttorkning i rumstemperatur, provet är kryokefixet och genomgår uttorkning och färgning vid låg temperatur via FS. Med cryoAPEX kan inte bara ett protein av intresse identifieras inom subcellulära fack, utan även ytterligare information kan lösas med avseende på dess topologi inom ett strukturellt bevarat membran. Vi visar att denna metod kan ge tillräckligt hög upplösning för att dechiffrera proteindistributionsmönster inom en organelllumen, och att skilja uppdelningen av ett protein inom en organelle i närheten av andra omärkta organeller. Vidare är cryoAPEX procedurmässigt enkelt och mottagligt för celler som odlas i vävnadskultur. Det är inte mer tekniskt utmanande än typisk cryofixation och frysa substitutionsmetoder. CryoAPEX är allmänt tillämplig för TEM-analys av membranprotein som kan märkas genetiskt.

Introduction

Biologiska studier inkluderar ofta frågor om att lösa subcellulära proteinlokalisering inom celler och organeller. Immunofluorescensmikroskopi ger en användbar lågupplösning sett till proteinlokalisering, och de senaste framstegen inom super-upplösning imaging driver gränserna för upplösning för fluorescerande taggade proteiner^1,2,3. Men elektronmikroskopi (EM) är fortfarande guldmyntfoten för imaging högupplöst cellulära ultrastruktur, även om märkning av proteiner är en utmaning.

Historiskt sett har flera EM-metoder använts för att närma sig frågor om strukturella proteinlokalisering. En av de vanligaste metoderna är immunoelectron mikroskopi (IEM), där antigen-specifika primära antikroppar används för att upptäcka protein av intresse. EM-signal genereras av tillämpningen av sekundära antikroppar som konjugeras med elektrontäta partiklar, oftast kolloidalt guld^4,5. Alternativt kan antikroppar som konjugeras med enzymer som pepparräd (HRP) användas för att producera en elektrontät fällning^6,7,8. Det finns två huvudsakliga metoder för IEM, besiktigad förinbäddning och postbäddsmärkning. I pre-inbäddning IEM, antikroppar införs direkt i celler, vilket kräver ljusfixering och permeabilisering av cellerna^9,10,11. Båda stegen kan skada ultrastructure^12,13. Utveckling av betydligt mindre antikroppar bestående av ett antikroppsFab-fragment som konjugerats med 1,4 nm nanoguld gör att mycket milda permeabiliseringsförhållanden kan användas. Nanogold är dock för liten för direkt visualisering under TEM och kräver ytterligare förbättringssteg för att bli synliga^14,15,16. I efterinbäddning IEM appliceras antikroppar på tunna delar av celler som har bearbetats helt genom fixering, uttorkning och inbäddning i harts¹⁷. Även om detta tillvägagångssätt undviker permeabilisering steg, bevara epitop av intresse under provberedning är utmanande^18,19,20. Den Tokuyasu metoden för ljusfixering följt av frysning, cryo-snittning, och antikroppar upptäckt ger förbättrad epitop bevarande^21,22. Men de tekniska kraven för cryo-ultramicrotomy, liksom den suboptimala kontrast som uppnås i cellen, är nackdelar²³.

Användningen av genetiskt kodade taggar eliminerar många av svårigheterna med IEM i samband med upptäckt av protein av intresse. En mängd olika taggar finns tillgängliga, inklusive HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG och metallothionein^{24,25,26,27,28,29,30,}31^,32. Var och en av dessa har fördelar jämfört med tidigare metoder, men var och en har också nackdelar som förhindrar utbredd användning. Dessa nackdelar sträcker sig från inaktivitet av HRP i cytosol till den stora storleken på ferritin taggen, ljuskänslighet ReAsH, och liten storlek och brist på kompatibilitet med cellulära färgning av metallothionein. Nyligen har ett protein som härrör från askorbat peroxidas e konstruerats som en EM-tagg, som heter APEX2^33,34. Som en peroxidas kan APEX2 katalysera oxidationen av 3,3’diaminobenzidine (DAB), som producerar en fällning som reagerar med osmiumetroxid för att ge lokal EM kontrast med minimal diffusion från protein av intresse (mindre än 25 nm)^33,35. Till skillnad från traditionella HRP-baserade metoder är APEX2 extremt stabil och förblir aktiv i alla cellulära fack³³. Prover kan bearbetas för TEM med traditionella EM-provfärgning och metoder som möjliggör bra visualisering av de omgivande strukturerna^33,34,36. På grund av sin ringa storlek, stabilitet och mångsidighet har APEX2 vuxit fram som en EM-tagg med stor potential.

Många av de tillvägagångssätt som diskuteras ovan kan antingen inte vara eller ännu inte har kombinerats med det aktuella läget i konsten i strukturella bevarande, kryofixation och låg temperatur fryssubstitution. Således lider de av brist på membran bevarande och / eller cell färgning för att bestämma korrekt proteinlokalisering. Detta begränsar nödvändigtvis upplösningen och tolkningen av de uppgifter som kan erhållas. Cryofixation av högtrycksfrysning (HPF) innebär snabb frysning av prover i flytande kväve vid ett högt tryck (~2 100 bar), vilket orsakar förvinning snarare än kristallisering av vattenprover, vilket bevarar celler i ett nästan inbyggt tillstånd^37,38^,39. HPF följs av frysningsubstitution (FS), en låg temperatur (-90 °C) uttorkning i aceton i kombination med inkubation med typiska EM-fläckar som osmiumetroxid och uranylacetat. HPF och FS ger tillsammans en klar fördel jämfört med traditionell kemisk fixering (en längre process som kan leda till artefakter) och alkoholuttorkning vid rumstemperatur eller på is (vilket kan leda till extraktion av lipider och sockerarter), och därmed är önskvärda att kombinera med de bästa EM-taggarna för proteindetektering.

En anledning till att HPF/FS inte har kombinerats med APEX2-märkning är att ljuskemisk fixering är en förutsättning för peroxidasreaktionen, vilket begränsar spridningen av DAB-reaktionsprodukten. I APEX2-studier följs hittills fixering och peroxidasreaktion av traditionella EM-metoder för färgning och alkoholuttorkning^33,36. Det har dock visat sig att efter kemisk fixering med HPF/FS ger en tydlig fördel i bevarandet över traditionell kemisk fixering och alkoholuttorkning ensam⁴⁰. Förlusten av strukturell integritet sett i traditionella TEM prover verkar mindre ansluten till fixering än uttorkning, som vanligtvis görs med alkohol i rumstemperatur eller på is, och kan leda till extraktion av lipider och socker^{arter 40,41}. För att utveckla cryoAPEX-metoden hypoteser vi att kemisk fixering och peroxidasreaktion, följt av HPF och FS, skulle ge ett optimalt resultat när det gäller strukturellbevarande.

Här presenterar vi cryoAPEX-protokollet, som kombinerar APEX2-märkning med kryofixation och fryser substitutionsmetoder (figur 1). Detta enkla protokoll består av transfection av ett APEX2-märkt protein av intresse, kemisk fixering av celler och peroxidasreaktionen. HPF och FS utförs sedan följt av typisk harts inbäddning och tunn snittning. TEM imaging avslöjar utmärkt bevarande av ultrastruktur med hjälp av denna metod. Dessutom observerades högupplöst subcellulär lokalisering och rumslig fördelning av en endoplasmatisk reticulum (ER) lumenalprotein. Denna metod är allmänt användbar för detektion av membranproteinlokalisering inom celler för elektronmikroskopi analys. I våra händer har metoden fungerat framgångsrikt för en mängd olika cellinjer som odlas i vävnadskultur, inklusive HEK-293T (mänskliga embryonala njurar), HeLa (human livmoderhalscancer), Cos7 (afrikansk grön apa njurfibroblast), och BHK (baby hamster njure). Detaljerade instruktioner beskrivs nedan med HEK-293T-celler.

Protocol

1. Cellkultur och transfection Seed HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller större vävnad kultur rätt och växa till 60%-90% sammanflödet i en cell kultur inkubator på 37 ° C och 5% CO2. Transfect celler med APEX2-märkta däggdjur uttryck plasmids med transfection reagens (se Table of Materials) enligt tillverkarens anvisningar. Vid 12–15 h efter transfection, tvätta celler en gång med fosfat buffrad koks (PBS). Ta bort celler från skålen genom mi…

Representative Results

För att jämföra det strukturella bevarandet med kryoAPEX-metoden med traditionell fixering och uttorkning, förberedde vi prover där ett endoplasmaiskt reticulummembran (ERM; ER membran) peptid var märkt med APEX2 och transfected i HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserar till ER:s cytoplasmatiska ansikte och ommodellerar ER-strukturen till morfologiskt distinkta strukturer som kallas organiserad smooth ER (OSER)34,42,43. OSE…

Discussion

CryoAPEX-protokollet som presenteras här ger en robust metod för att karakterisera lokaliseringen av membranproteiner i cellmiljön. Inte bara användningen av en genetiskt kodade APEX2 tagg ger exakt lokalisering av ett protein av intresse, men användningen av cryofixation och låg temperatur uttorkning ger utmärkt bevarande och färgning av den omgivande cellulära ultrastruktur. Kombinerat är dessa metoder ett kraftfullt verktyg för att lokalisera ett protein med hög precision i sitt subcellulära sammanhang.</…

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637-1G
Acetone (Glass Distilled)	Electron Microscopy Sciences	10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc	Electron Microscopy Sciences	60952
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL	VWR	82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin	Sigma-Aldrich	44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964	Sigma-Aldrich	44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)	Sigma-Aldrich	44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D	Sigma-Aldrich	44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm	Electron Microscopy Sciences	70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm	Electron Microscopy Sciences	70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement	Corning	355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm	Electron Microscopy Sciences	71008
Glass Knifemaker	Leica Microsystems	EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16120
HEK 293 Cells	ATCC	CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System	Leica Microsystems	EM PACT2	Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution	Fisher Scientific	50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm	Mager Scientific	16707898
Osmium Tetroxide, crystalline	Electron Microscopy Sciences	19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade	VWR	97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm	Mager Scientific	16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film	Electron Microscopy Sciences	FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)	Avantor Macron Fine Chemicals	7708-10
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm	VWR	25382-166
Ultra Glass Knife Strips	Electron Microscopy Sciences	71012
Ultramicrotome	Leica Microsystems	EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate	Electron Microscopy Sciences	22400