CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler

Summary

Denne protokol beskriver cryoAPEX-metoden, hvor et APEX2-mærket membranprotein kan lokaliseres ved transmissionselektronmikroskopi i optimalt bevaret celleultrastruktur.

Abstract

Vigtige cellulære begivenheder som signaltransduktion og membranhandel er afhængige af korrekt proteinplacering i cellulære rum. Forståelse af præcis subcellulær lokalisering af proteiner er derfor vigtigt for at besvare mange biologiske spørgsmål. Jagten på en robust etiket til at identificere protein lokalisering kombineret med tilstrækkelig cellulær bevarelse og farvning har været historisk udfordrende. Nylige fremskridt inden for elektronmikroskopi (EM) billeddannelse har ført til udvikling af mange metoder og strategier til at øge cellulære bevarelse og etiket mål proteiner. En forholdsvis ny peroxidase-baserede genetiske tag, APEX2, er en lovende leder i klonelige EM-aktive tags. Prøveforberedelse til mikromikroskopi af transmissionselektron (TEM) er også udviklet i de senere år med fremkomsten af kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) og lavtemperaturdehydrering og farvning via frysesubstitution (FS). HPF og FS giver fremragende bevarelse af cellulære ultrastruktur til TEM-billeddannelse, kun overgået af direkte kryo-billeddannelse af glasagtige prøver. Her præsenterer vi en protokol for cryoAPEX-metoden, som kombinerer brugen af APEX2-mærket med HPF og FS. I denne protokol mærkes et protein af interesse med APEX2, efterfulgt af kemisk fiksering og peroxidasereaktionen. I stedet for traditionel farvning og alkoholdehydrering ved stuetemperatur kryofikser prøven og gennemgår dehydrering og farvning ved lav temperatur via FS. Ved hjælp af cryoAPEX kan et protein af interesse ikke identificeres i subcellulære rum, men også yderligere oplysninger kan løses med hensyn til dets topologi i en strukturelt bevaret membran. Vi viser, at denne metode kan give høj nok opløsning til at dechifrere proteinfordelingsmønstre i et organellelumen og til at skelne mellem opdelingen af et protein i en organelle i nærheden af andre umærkede organeller. Desuden er cryoAPEX proceduremæssigt ligetil og modtagelig for celler dyrket i vævskultur. Det er ikke mere teknisk udfordrende end typiskkrofixation og frysesubstitutionsmetoder. CryoAPEX er almindeligt anvendelig for TEM analyse af enhver membran protein, der kan genetisk mærkes.

Introduction

Biologiske undersøgelser omfatter ofte spørgsmål om løsning af subcellulær proteinlokalisering i celler og organeller. Immunfluorescensmikroskopi giver en nyttig lav opløsning opfattelse af protein lokalisering, og de seneste fremskridt i super-opløsning imaging skubber grænserne for opløsning for fluorescerende mærkede proteiner^1,2,3. Men elektronmikroskopi (EM) forbliver guldstandarden for billeddannelse cellulære ultrastruktur med høj opløsning, selv om mærkning af proteiner er en udfordring.

Historisk set er flere EM-metoder blevet anvendt til at behandle spørgsmål om ultrastrukturel proteinlokalisering. En af de mest almindeligt anvendte metoder er immunelektronmikroskopi (IEM), hvor antigen-specifikke primære antistoffer bruges til at detektere protein af interesse. EM-signalet genereres ved anvendelse af sekundære antistoffer konjugeret med elektrontætte partikler, oftest kolloidguld^4,5. Alternativt kan antistoffer konjugeret med enzymer som hesteradisk peroxidase (HRP) anvendes til at producere en elektrontæt bundfald^6,7,8. Der findes to hovedtilgange til IEM, der kaldes forindlejring og postintegreringsmærkning. Ved præintegrering i IEM indføres antistoffer direkte i celler, hvilket kræver lysfiksering og permeabilisering af cellerne^9,10,11. Begge trin kan beskadige ultrastruktur^12,13. Udvikling af betydeligt mindre antistoffer bestående af et antistof Fab fragment konjugeret med 1,4 nm nanoguld tillader meget blid permeabilisering betingelser, der skal anvendes; Nanoguld er dog for lille til direkte visualisering under TEM og kræver yderligere forbedringstrin for at blive synlige^14,15,16. Ved post-indlejring IEM anvendes antistoffer på tynde dele af celler, som er blevet fuldt behandlet ved fiksering, dehydrering og indlejring i harpiks¹⁷. Selv om denne fremgangsmåde undgår gennemtrængelighedstrinnet, er det en udfordring at bevare interesseepicentret under hele prøveforberedelsen^18,19,20. Tokuyasu-metoden til lysfiksering efterfulgt af frysning, kryo-skæring og antistofdetektion giver forbedret epitopkonservering^21,22. Men de tekniske krav til kryo-ultramikrotomi, samt den sub-optimale kontrast opnået i cellen, er ulemper²³.

Brugen af genetisk kodede tags eliminerer mange af de vanskeligheder, iiem i forbindelse med påvisning af protein af interesse. En række tags er tilgængelige, herunder HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, og metallothionin^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Hver af disse har fordele i forhold til tidligere metoder, men hver har også ulemper, der forhindrer udbredt brug. Disse ulemper spænder fra inaktivitet af HRP i cytosol til den store størrelse af ferritin tag, lys følsomhed ReAsH, og lille størrelse og manglende kompatibilitet med cellulære farvning af metallothionin. For nylig, et protein fremstillet af ascorbat peroxidase er blevet manipuleret som en EM-tag, opkaldt APEX2^33,34. Som peroxidase kan APEX2 katalysere oxidationen af 3,3′ diaminobenzidin (DAB), der producerer en bundfald, der reagerer med osmiumtetroxid for at give lokal EM-kontrast med minimal diffusion fra proteinaf interesse (mindre end 25 nm)^33,35. I modsætning til traditionelle HRP-baserede metoder er APEX2 ekstremt stabil og forbliver aktiv i alle cellerum³³. Prøver kan forarbejdes for TEM ved hjælp af traditionel EM-prøvefarvning og metoder , der giver mulighed for god visualisering af de omkringliggende konstruktioner^33,34,36. På grund af sin lille størrelse, stabilitet og alsidighed, apex2 har vist sig som en EM tag med stort potentiale.

Mange af de tilgange, der er beskrevet ovenfor, kan enten ikke kombineres med den aktuelle tekniske situation inden for ultrastrukturel konservering, kryoviation og frysesubstitution ved lav temperatur. Således lider de af mangel på membran konservering og / eller celle farvning at bestemme nøjagtig protein lokalisering. Dette begrænser nødvendigvis opløsningen og fortolkningen af de data, der kan indhentes. Kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) indebærer hurtig frysning af prøver i flydende nitrogen ved et højt tryk (~ 2.100 bar), som forårsager vitrification snarere end krystallisering af vandige prøver, og dermed bevare celler i en næsten hjemmehørende tilstand^37,38,39. HPF efterfølges af frysesubstitution (FS), en lav temperatur (-90 °C) dehydrering i acetone kombineret med inkubation med typiske EM-pletter såsom osmiumtetroxid og uranylacetat. HPF og FS giver tilsammen en klar fordel i forhold til traditionel kemisk fiksering (en længere proces, der kan føre til artefakter) og alkoholdehydrering ved stuetemperatur eller is (hvilket kan føre til udvinding af lipider og sukker), og derfor er ønskeligt at kombinere med de bedste EM-tags til påvisning af protein.

En af grundene til, at HPF/FS ikke er blevet kombineret med APEX2-mærkning, er, at lyskemisk fiksering er en forudsætning for peroxidasereaktionen, hvilket begrænser udbredelsen af DAB-reaktionsproduktet. I APEX2-undersøgelser indtil videre efterfølges fiksering og peroxidasereaktion af traditionelle EM-metoder til farvning og alkoholdehydrering^33,36. Det er imidlertid blevet påvist, at efter kemisk fiksering med HPF/FS giver en klar fordel i konserveringen i forhold til traditionel kemisk fiksering og alkoholdehydrering alene⁴⁰. Tabet af ultrastrukturel integritet, der ses i traditionelle TEM-prøver, synes mindre forbundet med fiksering end til dehydrering, hvilket typisk sker ved hjælp af alkohol ved stuetemperatur eller is, og kan føre til ekstraktion af lipider og sukker^40,41. For at udvikle cryoAPEX-metoden antager vi, at kemisk fiksering og peroxidasereaktion efterfulgt af HPF og FS ville give et optimalt resultat med hensyn til ultrastrukturel konservering.

Her præsenterer vi cryoAPEX-protokollen, som kombinerer APEX2-mærkning med kryopræks- og frysesubstitutionsmetoder (figur 1). Denne enkle protokol består af omladning af et APEX2-mærket protein af interesse, kemisk fiksering af celler og peroxidasereaktionen. HPF og FS udføres derefter efterfulgt af typisk harpiksintegrering og tynd skæring. TEM imaging afslører fremragende bevarelse af ultrastruktur ved hjælp af denne metode. Derudover blev der observeret højopløsningssubcellulær lokalisering og rumlig fordeling af et endoplasmisk retikulum (ER) lumenalprotein. Denne metode er meget nyttig til påvisning af membranproteinlokalisering i celler til elektronmikroskopianalyse. I vores hænder har metoden fungeret med succes for en række cellelinjer dyrket i vævkultur, herunder HEK-293T (human embryonal nyre), HeLa (human livmoderhalskræft), Cos7 (afrikansk grøn abe nyre fibroblast), og BHK (baby hamster nyre). Detaljerede instruktioner er beskrevet nedenfor ved hjælp af HEK-293T celler.

Protocol

1. Cellekultur og omladning Frø HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller større væv kultur parabol og vokse til 60% -90% sammenløb i en celle kultur inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Transfect celler med APEX2-mærkede pattedyr udtryk plasmider ved hjælp af transfektionsreagens (se Tabel over materialer)i henhold til producentens anvisninger. Ved 12-15 timer efter omladning en gang med fosfat buffered saltvand (PBS). Fjern celler fra skålen ved skånsom vas…

Representative Results

For at sammenligne den ultrastrukturelle konservering ved hjælp af cryoAPEX-metoden med traditionel fiksering og dehydrering udarbejdede vi prøver, hvor en endoplasmisk reticulummembran (ERM; ER membran) peptid blev mærket med APEX2 og transfected i HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserer til erens cytoplasmatiske ansigt og ommodellerer ER-strukturen til morfologisk adskilte strukturer kendt som organiseret smooth ER (OSER)34,42,43<…

Discussion

Den cryoAPEX protokol præsenteres her giver en robust metode til at karakterisere lokaliseringen af membran proteiner i cellulære miljø. Ikke alene giver brugen af et genetisk kodet APEX2-tag præcis lokalisering af et protein af interesse, men brugen af kryoixation og lavtemperaturdehydrering giver fremragende bevarelse og farvning af den omgivende cellulære ultrastruktur. Kombineret er disse tilgange et kraftfuldt værktøj til lokalisering af et protein med høj præcision i sin undercellulære kontekst.

<p cl…

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637-1G
Acetone (Glass Distilled)	Electron Microscopy Sciences	10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc	Electron Microscopy Sciences	60952
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL	VWR	82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin	Sigma-Aldrich	44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964	Sigma-Aldrich	44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)	Sigma-Aldrich	44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D	Sigma-Aldrich	44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm	Electron Microscopy Sciences	70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm	Electron Microscopy Sciences	70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement	Corning	355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm	Electron Microscopy Sciences	71008
Glass Knifemaker	Leica Microsystems	EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16120
HEK 293 Cells	ATCC	CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System	Leica Microsystems	EM PACT2	Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution	Fisher Scientific	50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm	Mager Scientific	16707898
Osmium Tetroxide, crystalline	Electron Microscopy Sciences	19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade	VWR	97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm	Mager Scientific	16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film	Electron Microscopy Sciences	FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)	Avantor Macron Fine Chemicals	7708-10
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm	VWR	25382-166
Ultra Glass Knife Strips	Electron Microscopy Sciences	71012
Ultramicrotome	Leica Microsystems	EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate	Electron Microscopy Sciences	22400