Inguinal Subkutan hvit fettvev (ISWAT) Transplantasjon Modell av Murine Holmer
Summary
I denne protokollen er en metode for murine holmeisolasjon og transplantasjon i det inuinale subkutane hvite fettvevet beskrevet. Isolerte syngeneiske murine holmer transplanterer til en murine mottaker ved hjelp av en kjeller membran hydrogel. Blodsukkernivået til mottakerne overvåkes, og histologianalyse av holmetransplantatene utføres.
Abstract
Pankreas holmetransplantasjon er en veletablert terapeutisk behandling for type 1 diabetes. Nyrekapselen er det mest brukte stedet for holmetransplantasjon hos gnagermodeller. Den stramme nyrekapselen begrenser imidlertid transplantasjonen av tilstrekkelige holmer hos store dyr og mennesker. Det inuinale subkutane hvite fettvevet (ISWAT), et nytt subkutant rom, ble funnet å være et potensielt verdifullt sted for holmetransplantasjon. Dette nettstedet har bedre blodtilførsel enn andre subkutane mellomrom. Videre har ISWAT plass til en større holmemasse enn nyrekapselen, og transplantasjon i den er enkel. Dette manuskriptet beskriver prosedyren for mus holme isolasjon og transplantasjon i ISWAT stedet for syngeneic diabetisk mus mottakere. Ved hjelp av denne protokollen ble murine bukspyttkjerteløyer isolert av standard kollagennase fordøyelse og en kjellermembran matrise hydrogel ble brukt til å fikse rensede holmer i ISWAT-området. Blodsukkernivået til mottakermusene ble overvåket i mer enn 100 dager. Islet grafts ble hentet på dag 100 etter transplantasjon for histologisk analyse. Protokollen for holmetransplantasjon i ISWAT-nettstedet beskrevet i dette manuskriptet er enkel og effektiv.
Introduction
Den verdensomspennende forekomsten og forekomsten av diabetes mellitus type 1 (T1DM) øker raskt, ifølge statistiske data fra International Diabetes Federation (IDF)1. Holmetransplantasjon er en av de mest lovende tilnærmingene for behandling av T1DM4. Siden det store gjennombruddet i klinisk holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen2 ble rapportert, fungerende holmegraftoverlevelse hos T1DM-mottakere etter 5 år nå når ca 50%3.
Tidligere ble flere transplantasjonssteder, som lever, nyrekapsel, milt, intramuskulær region, subkutan plass, benmarg og omentalpose utforsket for eksperimentell holmetransplantasjon5,6,7. Noen av de ovennevnte stedene har blitt testet i kliniske innstillinger8. Selv om holmetransplantasjon i leveren fortsatt er den mest brukte metoden i klinisk anvendelse i dag9,er det flere viktige problemer å løse når du bruker dette nettstedet. For eksempel, hvordan redusere tidlig tap av transplanterte holmer forårsaket av øyeblikkelig blod mediert inflammatorisk reaksjon (IBMIR) og dårlig oksygenering forsyning10,11 og hvordan å hente holme grafts om nødvendig, fordi de diffust lokalisere i leveren. Nyrekapselen kan være et ideelt sted for gnagermottakere. Den stramme nyrekapselen begrenser imidlertid transplantasjonen av tilstrekkelige allogene holmer hos mennesker, selv om det kan være bedre egnet for holmexenotransplantasjon på grunn av de svært rensede svineøyene som brukes klinisk5,12. Derfor er søket etter et mer egnet sted for holmetransplantasjon pågår.
Det subkutane rommet kan brukes som et klinisk aktuelt sted for holmetransplantasjon på grunn av tilgjengeligheten. Effektiviteten av holmetransplantasjon i det subkutane rommet er imidlertid ekstremt lav, og krever dermed et relativt stort antall holmer for å reversere hyperglykemi13. Nylig fant et japansk forskningsteam ISWAT, et nytt subkutan sted overlegen for holmetransplantasjon i en murine modell sammenlignet med leveren14. ISWAT inneholder epigastrisk arterie og vene, slik at den rike blodtilførselen kan sikre at holmetransplantatrevaskularisering. I dette manuskriptet foreslår vi en enkel implantasjonsmetode ved hjelp av en kjellermembranmatrisehydrogel for å fikse syngeneiske murine-holmer i ISWAT. Denne protokollen viser seg effektiv for holmetransplantasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bukspyttkjertel holmetransplantasjon er en lovende terapi for å behandle T1DM. Effekten av denne behandlingen påvirkes av mange faktorer, og det er ekstremt viktig å velge et optimalt sted for holmeimplantasjon. Det ideelle anatomiske stedet for holmetransplantasjon bør ha følgende egenskaper: tilgjengelighet for enkel transplantasjon, biopsi og graft gjenfinningprosedyrer; reduserte komplikasjoner; høy suksessrate for blodsukkerkontroll; og langsiktig overlevelse av holmen grafts15,</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medisinsk disiplin Bygging av Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medisinsk Vitenskapelig forskningsstiftelse i Guangdong-provinsen i Kina (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
Riferimenti
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O’Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
