In questo protocollo, viene descritto un metodo di isolamento murine ilet e trapianto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale. Le isole di murine singeniche isolate vengono trapiantate in un recipiente murino utilizzando un idrogel di membrana sotterranea. Viene monitorato il livello di glucosio nel sangue dei destinatari e viene eseguita l'analisi istologia degli innesti di islet.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trapianto di islet pancreatico è un trattamento terapeutico consolidato per il diabete di tipo 1. La capsula renale è il sito più comunemente usato per il trapianto di isolotto nei modelli di roditori. Tuttavia, la capsula renale stretta limita il trapianto di isole sufficienti negli animali di grandi dimensioni e negli esseri umani. Il tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale (ISWAT), un nuovo spazio sottocutaneo, è stato trovato come un sito potenzialmente prezioso per il trapianto di isolotto. Questo sito ha un migliore apporto di sangue rispetto ad altri spazi sottocutanei. Inoltre, l'ISWAT ospita una massa di isolotto più grande della capsula renale, e il trapianto in esso è semplice. Questo manoscritto descrive la procedura di isolamento e trapianto di isolotti di topo nel sito ISWAT dei destinatari di topi diabetici singenici. Utilizzando questo protocollo, le isole pancreatiche murine sono state isolate dalla digestione standard del collagenase e un idrogel a matrice di membrana seminterrato è stato utilizzato per fissare le isole purificate nel sito ISWAT. I livelli di glucosio nel sangue dei topi riceventi sono stati monitorati per più di 100 giorni. Gli innesti di isle sono stati recuperati al giorno 100 dopo il trapianto per l'analisi istologica. Il protocollo per il trapianto di isolotto nel sito ISWAT descritto in questo manoscritto è semplice ed efficace.
Introduzione
L'incidenza e la prevalenza a livello mondiale del diabete mellito di tipo 1 (T1DM) sono in rapido aumento, secondo i dati statistici della Federazione Internazionale del Diabete (IDF)1. Il trapianto di islet è uno degli approcci più promettenti per il trattamento del T1DM4. Dal momento che è stata riportata la grande scoperta nel trapianto di isolotto clinico utilizzando il protocollo di Edmonton2, la sopravvivenza dell'innesto di isolotto funzionante nei destinatari T1DM dopo 5 anni raggiunge circa il 50%3.
In passato, sono stati esplorati dive....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure descritte in questo protocollo hanno seguito i principi del benessere degli animali del Comitato di revisione etica dell'Ospedale del Secondo Popolo di Shenzhen. I destinatari e i donatori di innesti di isolotto erano topi maschi C57BL/6 di una settimana acquistati presso il Medical Animal Center della provincia del Guangdong. La procedura di raccolta, isolamento, coltura o somministrazione delle cellule raccolte è stata effettuata in condizioni asettiche.
1. Preparazione dell'isola
- Preparare una soluzione di lavoro di tipo G di collagenana. Pesare collagenase Tipo V e sciogliere con il buffer di D-Hank per una ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In questo protocollo sono introdotte due procedure: preparazione dell'isolotto murine e trapianto di isolotto nel sito ISWAT. Nella prima procedura, dopo aver perfuso e digerito con la soluzione di collagenasi di tipo V, purificando con Histopaque-1119 e Histopaque-1077 e un ulteriore passo di raccolta a mano, le isole murine isolate saranno sufficientemente pure per il trapianto (come mostrato nella Figura 1) e le isole isolate che hanno un'elevata vitalità saranno utilizzate per il trapian.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il trapianto di issolota del pancreas è una terapia promettente per il trattamento del T1DM. L'effetto di questa terapia è influenzato da molti fattori e la scelta di un sito ottimale per l'impianto delle isolotto è estremamente importante. Il sito anatomico ideale per il trapianto di isolotto dovrebbe avere le seguenti caratteristiche: accessibilità per semplici procedure di trapianto, biopsia e recupero dell'innesto; complicanze ridotte; alto tasso di successo del controllo della glicemia; e la sopravvivenza a lungo te.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia di Guangdong (2019), Sanming Project of Medicine a Shenzhen (S201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20229204849975, GJ-20170314171357555), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (S Scientific Research Foundation della Provincia cinese del Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m Unità di filtraggio azionata da siringa | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| provetta da centrifuga da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Pipetta Pasteur da 5 mL | JingAn Biological, Cina | J00085 | |
| Siringa da 5 mL | Szboon, Cina | 20170829 | |
| Provetta conica da 50 mL | Sutura chirurgica Corning | 430829 | |
| 5-0 | sh-Jinhuan, Cina | CR537 | |
| 60 mL siringa | Szboon, Cina | 20170623 | |
| 75% Etanolo | LIRCON, Cina | 9180527 Alexa | |
| Fluor 488 asino anti-topo IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Diluizione (1:200) |
| anti-topo Glucagone anticorpo | Abcam | ab10988 | Diluizione (1:100) |
| anti-topo insulina anticorpo | Cell Tecnologia di segnalazione | 3014s | Diluizione (1:100) |
| ago di perfusione a punta smussata | Oloey, Cina | 005 | 32G, giallo |
| BSA | Meilune, Cina | MB4219 | |
| C57BL/6 Topi | Medical Animal Center della provincia | 8~10 settimane | |
| piatto per coltura cellulare | BIOFIL, Cina | TCD000100 | generale, non trattato, diametro 87,8 mm |
| centrifuga | Thermo Scientific | ST16R | |
| cefalosporina | Lukang medical, Cina | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, Cina | CP-8000 | |
| collagenasi Tipo V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tampone di D-hank | Coolaber, Cina | PM5140-10 | |
| ditizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Mezzi di colorazione eosina | Beyotime Biotech, Cina | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| diacetato di fluoresceina (FDA) | Thermo Fisher | Microscopio fluorescente F1303 | |
| Puntali per pipette caricanti | Leica | ||
| HBSS | Coolaber, Cina | ematossilina PM5150-10 | |
| Tecnologia di segnalazione cellulare | 14166S | ||
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich RNBG0536 | ||
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Matrice di membrana basale |
| Iodophor | LIRCON, Cina | 5190313 | |
| piatto di coltura a tenuta di luce | DVS, Cina | AN-5058548 | autocostruito, piatto di vetro spruzzato con vernice nera |
| Nastro adesivo medico | Cofoe, Cina | K12001 | |
| micropinzette non invasive | RWD Life Science | F11033-11 e F12016-15 | |
| Sistema di monitoraggio della glicemia di base One Touch ultraeasy | Johnson & Forbici | ||
| RWD Life Science | S12012-12 e S11001-08 | ||
| P/S (penicillina / streptomicina) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodico | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Ioduro di propidio | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocina) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Striscia reattiva | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-coniugato Capra anti-coniglio IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Diluizione (1:200) |
| morsetto vascolare | RWD Life Science | R31006-04 |
Riferimenti
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
