Modelo de transplante de tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT) de Isletas murina

Summary

Neste protocolo, um método de isolamento e transplante de isto de murina no tecido adiposo branco subcutâneo inguinal é descrito. Ishotas singeneicas isoladas são transplantadas em um receptor de murina usando um hidrogel de membrana do porão. O nível de glicemia dos receptores é monitorado, e a análise de histologia dos enxertos de lumiçal é realizada.

Abstract

O transplante de lélete pancreática é um tratamento terapêutico bem estabelecido para diabetes tipo 1. A cápsula renal é o local mais usado para transplante de ilhotas em modelos de roedores. No entanto, a cápsula renal apertada limita o transplante de ilhotas suficientes em animais de grande porte e humanos. O tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT), um novo espaço subcutâneo, foi encontrado como um local potencialmente valioso para o transplante de lélete. Este local tem melhor suprimento de sangue do que outros espaços subcutâneos. Além disso, a ISWAT acomoda uma massa de ilhota maior que a cápsula renal, e o transplante nela é simples. Este manuscrito descreve o procedimento de isolamento e transplante de lélete de camundongos no local da ISWAT de receptores de camundongos diabéticos sinódicos. Usando este protocolo, ilhotas pancreáticas de murina foram isoladas pela digestão colagenase padrão e um hidrogel de matriz de membrana do porão foi usado para fixar as ilhotas purificadas no local da ISWAT. Os níveis de glicose no sangue dos camundongos receptores foram monitorados por mais de 100 dias. Enxertos de lélete foram recuperados no dia 100 após transplante para análise histológica. O protocolo para transplante de lélete no site da ISWAT descrito neste manuscrito é simples e eficaz.

Introduction

A incidência mundial e a prevalência de diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) estão aumentando rapidamente, de acordo com os dados estatísticos da Federação Internacional de Diabetes (IDF)¹. O transplante de lélete é uma das abordagens mais promissoras para o tratamento do T1DM⁴. Uma vez que o grande avanço feito no transplante de lélete clínica usando o protocolo Edmonton² foi relatado, a sobrevivência do enxerto de islet em funcionamento em receptores T1DM depois de 5 anos agora atinge cerca de 50%³.

No passado, foram explorados vários locais de transplante, como fígado, cápsula renal, baço, região intramuscular, espaço subcutâneo,medula óssea e bolsa omental^5,6,7. Alguns dos locais acima foram testados em configurações clínicas⁸. Embora o transplante de lita no fígado continue sendo o método mais utilizado na aplicação clínica atualmente^9,há vários problemas importantes a serem enfrentados ao usar este local. Por exemplo, como reduzir a perda precoce das léletas transplantadas causadas pela reação inflamatória mediada pelo sangue instantâneo (IBMIR) e pelo suprimento de oxigenação ruim^10,11 e como recuperar os enxertos de luma, se necessário, porque eles se localizam difusamente no fígado. A cápsula renal pode ser o local ideal para os receptores de roedores. No entanto, a cápsula renal apertada limita o transplante de ilhotas alogênicas suficientes em humanos, embora possa ser um ajuste melhor para o xenotransplante ilhota devido aos preparos altamente purificados da ilhota suína utilizadas clinicamente^5,12. Portanto, a busca por um local mais adequado para transplante de lélete está em andamento.

O espaço subcutâneo pode ser usado como local clinicamente aplicável para transplante de ilhotas devido à sua acessibilidade. No entanto, a eficiência do transplante de islet no espaço subcutâneo é extremamente baixa, exigindo assim um número relativamente grande de lésitas para reverter a hiperglicemia¹³. Recentemente, uma equipe de pesquisa japonesa encontrou o ISWAT, um novo local subcutâneo superior ao transplante de islet em um modelo de murina quando comparado com o fígado¹⁴. A ISWAT contém a artéria etiátrica e veia, de modo que o rico suprimento de sangue pode garantir a revascularização do enxerto de ilhota. Neste manuscrito, propomos um método fácil de implantação usando um hidrogel de matriz de membrana do porão para corrigir ishotas singeneic murina na ISWAT. Este protocolo se mostra eficaz para transplante de lélete.

Protocol

Todos os procedimentos neste protocolo seguiram os princípios do bem-estar animal do Comitê de Revisão ética do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. Os receptores e doadores de enxerto de islet eram de 8 a 10 semanas de idade C57BL/6 camundongos machos comprados do Centro Médico animal da província de Guangdong. O procedimento da colheita, isolamento, cultura ou administração das células colhidas foi realizado em condições assépticas. 1. Preparação de islet Prepare uma…

Representative Results

Dois procedimentos são introduzidos neste protocolo: preparação de islet de murina e transplante de lélete no local da ISWAT. No primeiro procedimento, após perfundir e digerir com solução colagenase tipo V, purificando com Histopaque-1119 e Histopaque-1077 e uma etapa adicional de colheita de mão, as ilhotas murina isoladas serão suficientemente puras para transplante (como mostrado na Figura 1) e as ilhotas isoladas que possuem alta viabilidade serão usadas para transplante (como…

Discussion

O transplante de lélete de pâncreas é uma terapia promissora para tratar o T1DM. O efeito dessa terapia é afetado por muitos fatores e escolher um local ideal para implantação de léletes é extremamente importante. O local anatômico ideal para transplante de lélete deve ter as seguintes características: acessibilidade para simples transplante, biópsia e procedimentos de recuperação de enxerto; complicações reduzidas; alta taxa de sucesso do controle de glicose no sangue; e sobrevivência a longo prazo dos …

Materials

0.22 μm Syringe-driven Filter Unit	Merck Millipore	SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette	JingAn Biological, China	J00085
5 mL syringe	Szboon, China	20170829
50 mL conical tube	Corning	430829
5-0 surgical suture	sh-Jinhuan, China	CR537
60 mL syringe	Szboon, China	20170623
75% Ethanol	LIRCON, China	9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)	Invitrogen	A21202	Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody	Abcam	ab10988	Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody	Cell Signaling Technology	3014s	Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle	Oloey, China	005	32G, yellow
BSA	Meilune, China	MB4219
C57BL/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province		8~10 weeks
cell culture dish	BIOFIL, China	TCD000100	General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge	Thermo Scientific	ST16R
cephalosporin	Lukang medical, China	150303
CMRL-1066	Sigma-Aldrich	C0422
Codos Pet Clipper	Szcodos, China	CP-8000
collagenase Type V	Sigma	C9262
DAPI	Thermo Fisher	D1306
D-hank's buffer	Coolaber, China	PM5140-10
dithizone	Sigma-Aldrich	D5130
Dnase I	Sigma-Aldrich	D4263
Eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
FBS	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
fluorescein diacetate (FDA)	Thermo Fisher	F1303
fluorescent microscope	Leica	DMIL
gel-loading pipet tips	Corning	CLS4884
HBSS	Coolaber, China	PM5150-10
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology	14166S
HISTOPAQUE-1077	Sigma-Aldrich	RNBG0522
HISTOPAQUE-1119	Sigma-Aldrich	RNBG0536
Hydrogel	BD Biosciences	356234	Basement Membrane Matrix
Iodophor	LIRCON, China	5190313
light-tight culture dish	DVS, China	AN-5058548	self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape	Cofoe, China	K12001
non-invasive microtweezers	RWD Life Science	F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
ophthalmic scissors	RWD Life Science	S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin)	Gibco	15140-122
pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P-010
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
STZ (streptozotocin)	Sigma-Aldrich	S0130
Test Strip	GenUltimate	100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00007-2	Dilution (1:200)
vascular clamp	RWD Life Science	R31006-04