应用活细胞成像和低温电子断层扫描解决军团菌肺瘤点/Icm分泌系统的时空特征
Summary
细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，侧重于定义静态和动态过程，这些过程决定了大型大分子机器的功能。在这里，定量活细胞成像和低温电子断层扫描的集成用于研究军团菌肺瘤IV型分泌系统架构和功能。
Abstract
军团菌的点/Icm分泌系统是一种复杂的IV型分泌系统（T4SS）纳米机器，在细菌极处进行定位，并调解蛋白质和DNA基质向靶细胞的输送，这一过程通常需要细胞到细胞直接接触。我们最近通过低温电子断层扫描（cryo-ET）解决了Dot/Icm仪器的结构，并表明它形成了一个细胞包络跨度通道，连接到细胞质复合体。应用两种补充方法，保持标本的原生结构，荧光显微镜在活细胞和低温-ET中，允许蛋白质的原位可视化和同化每个机器部件相对于其他点/Icm子单位的生产时间。为了研究极性定位的要求，并描述与T4SS机器生物成因相关的动态特征，我们将编码超级文件夹绿色荧光蛋白的基因融合到Dot/Icm ATPase基因的原生位置。以下方法集成了活细胞和低温-ET的定量荧光显微镜，以量化这些蛋白质在完整细菌细胞中的极性定位、动力学和结构。应用这些方法研究军团菌肺炎T4SS有助于描述Dot/Icm系统的功能，并可用于研究利用T4SS或其他类型的细菌分泌复合物的各种细菌病原体。
Introduction
军团菌肺杆菌（L.肺炎杆菌），军团病的病因，栖息在淡水水库，细菌通过感染和复制水生自由游泳原生动物传播。L. 肺尘埃球菌在吸入饮用水源中的气溶胶细菌时，导致人类疾病爆发。在受感染的细胞中，宿主通路的颠覆使L.肺炎杆菌能够延缓其所在的真空细胞的内皮成熟，并促进支持细菌复制的细胞舱的生物生成。这个过程是由一个专门的细菌类型IVB分泌系统（T4BSS）称为Dot/Icm及其的300多个”效应器”蛋白质的品种，在感染期间被转移到宿主细胞群素，以促进细胞功能1，2，3，4，5的操纵。缺乏功能点/Icm仪器的突变体不能将效应器输送到宿主细胞索中，在细胞内复制方面存在缺陷，在疾病6、7的动物模型中具有avirule。
许多细菌物种已经开发出了感染过程所需的极其复杂和动态的多组分机。其他T4BSS，如Dot/Icm系统也是必不可少的细胞内复制细菌病原体，如科西拉布鲁内蒂和里基西拉格丽利。虽然T4BSS与原型型IVA系统具有进化关系，后者调解DNA转移，并能提供有限的有效蛋白，但Dot/Icm系统拥有几乎两倍的机器部件，并提供各种各样的效应器。据推测，这种组件数量的扩大使Dot/Icm设备能够轻松容纳和集成新的效应器8，9。
我们最近使用低温电子断层扫描（cryo-ET）就地解决了Dot/Icm仪器的结构，并表明它形成了一个细胞包络跨度通道，连接到细胞质复合体。进一步分析表明，通过与细胞体ATPase DotO的相互作用，圆细胞状ATPase DotB与L.肺尘埃球细胞极的点/Icm系统有关。我们发现，DotB在大多数细菌细胞中显示一个循环球状运动，这表明这种ATPase存在于动态的细胞群中，但也与极性点/Icm复合物有关联。此外，DotO 形成与内膜复合体相关的 DotO 二分器的 hexamic 组件，DotB hexamer 连接到此细胞质复合物的基座。DotB-DotO 能量复合体的组装创建了一个细胞质通道，通过 T4SS（图 1）10引导基材的易位。
尽管最近取得了这些进展，但关于Dot/Icm系统如何发挥作用以及每种蛋白质如何组装形成一个活性装置8知之甚少。发现Dot/Icm T4SS的调节回路对于理解宿主-病原体相互作用的分子机制至关重要。因此，我们讨论如何使用活细胞显微镜和低温-ET来检测和表征使用超级文件夹GFP（sfGFP）标记的基本L.肺活血杆菌/Icm系统组件。使用定量荧光显微镜，DotB 的极定位将在野生类型背景中定义，或者当 IV 型系统被删除时。延时显微镜将用于量化点/Icm细胞学的定位和动力学差异。
与其他体外系统相比，实时成像和低温ET等两种互补方法的组合应用提供了优势。这两种方法均以完整的细胞执行，并保护T4BSS的自然环境，从而最大限度地减少样品制备过程中原生结构的干扰。由于蛋白质的过度表达可能会损害分泌器的分泌器的分泌器，sfGFP融合通过异位交换返回到军团菌染色体，以便每个融合在单拷贝中编码，并且表达由内源促进者驱动。色谱编码聚变的可视化能够量化在规定的时间点表达的蛋白质的确切水平。Cryo-ET 在确定分泌系统结构方面也有许多优点。最显著的优点是低温-ET样品由冷冻完整细胞组成，在细菌细胞结构中保留原生复合物。因此，低温-ET可能比生化纯化方法更可取，后者提取膜复合物，并可能从核心设备中去除外周蛋白或修改整体结构。此外，用笨重的蛋白质（如 sfGFP）标记感兴趣的蛋白质，可添加低温-ET 可检测的质量，并有助于将 Dot/Icm 仪器的不同子复合物映射到低温-ET 获得的结构上。
这种方法是一个强大的工具，用于发现在细菌细胞膜中组装的多分子复合物的结构信息。解释使用这些技术阐明的结构将有助于现场了解 T4BSS 组件的工作原理、为什么函数需要这么多组件、组件如何在更复杂范围内交互以及这些组件的功能子组件执行。
Protocol
Representative Results
Discussion
阐明细菌分泌系统的功能是全面了解宿主-病原体相互作用的关键。分泌系统是复杂的机器，可以将效应剂蛋白质注入宿主细胞，在某些情况下，它促进建立支持细菌复制的亚细胞利基。上述方法为研究呼吸系统病原体军团菌肺杆菌的Dot/Icm分泌系统提供了重要的新工具，为有效器易位机制提供了线索，对其致病性至关重要。这种方法可以通过利用活细菌细胞成像和结构研究来解剖其分子水?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
华盛顿特区和C.R.R.得到NIH的支持（R37AI041699和R21AI130671）。D.P.、B.H.和J.L得到国家卫生研究院（R01AI087946和R01GM107629）的支持。
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
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