Denne protokoll demonstrerer nøyaktig og reproduserbar måling av oksygen forbruket i ikke-menneskelige primater bukspyttkjertelen holmer. Holmen lasting teknikker og belegg av mikroplate gir et rammeverk for effektiv måling av åndedrett i andre typer kultivert spheroids.
Måling av oksygen forbruket i spheroid klynger av celler, slik som ex vivo bukspyttkjertelen holmer, har historisk vært utfordrende. Vi viser måling av Holme oksygenforbruk ved hjelp av en 96-brønn mikroplate designet for måling av oksygen forbruket i spheroids. I denne analysen, spheroid mikroplater er belagt med en celle og vev lim på dagen før analysen. Vi bruker et lite volum av selvklebende løsning for å oppmuntre Holme tilslutning til bare bunnen av brønnen. På dagen for analysen, er 15 holmer lastet direkte inn i bunnen av hver brønn ved hjelp av en teknikk som sikrer optimal posisjonering av holmer og nøyaktig måling av oksygenforbruk. Ulike aspekter ved mitokondrie åndedrett er analysert farmakologisk i ikke-menneskelige primater holmer, inkludert ATP-avhengig åndedrett, maksimal åndedrett, og Proton lekkasje. Denne metoden gir konsistente, reproduserbar resultater med bare et lite antall holmer per brønn. Det kan teoretisk brukes til enhver kultivert spheroids av tilsvarende størrelse.
For å opprettholde normale blodsukker nivåer må celle i bukspyttkjertelen føle økning i glukose og skille insulin tilsvarende. Koplingen av insulin sekresjon med glukose nivåer er direkte knyttet til glukose metabolisme og produksjonen av ATP gjennom mitokondrie oksidativt fosforylering. Dermed mitokondrier spille en avgjørende rolle i stimulans-sekresjon kopling1. Vurdering av β-celle mitokondrie funksjon kan avdekke defekter som fører til nedsatt insulin sekresjon. Utskillelsen av glukagon av bukspyttkjertelen α-celler er også nært knyttet til mitokondrie funksjon2. Selv om udødeliggjort Holme Cell Lines har vist seg nyttig for enkelte typer analyser, fysiologi av disse cellene ikke nøyaktig recapitulate hele Holme funksjon, som illustrert av potensiering av insulin sekresjon av glukagon3,4 og hemming av glukagon sekresjon av insulin/somatostatin5,6 i intakt holmer. Dette demonstrerer behovet for måling av oksygenforbruk ved bruk av hele, intakte holmer.
Teknikker for måling av holmen celle respirometry har utviklet seg over tid, fra bruk av oksygen-sensitive fluorescerende fargestoffer7 til solid-state sensorer som direkte måler oksygenforbruk8. Opprinnelig utviklet for monolag, tilhenger celler, brukte cellekultur plate systemer har vist seg å være ineffektiv for bukspyttkjertelen holmer. Som holmer ikke naturlig holder seg til brønnene, er de tilbøyelige til å bli skjøvet til periferien av kulturen godt resulterer i unøyaktig måling av oksygenforbruk9. For å bekjempe dette problemet, spesialiserte 24-brønn plater med en sentral depresjon som kan inneholde holmer ble utviklet9. Men 24-brønn plate systemet var begrenset av det store antallet holmer som kreves (50-80 per brønn) og antall forhold som kan testes samtidig10. Den nylige utviklingen av 96-brønn mikroplater utformet spesielt for ekstracellulære Flux analyse i spheroids har overvunnet disse barrierene, slik at måling av Holmen respirometry med 20 eller færre holmer per brønn10.
Her viser vi bruken av dette systemet til å måle oksygen forbruket i holmer fra den japanske macaque (Macaca fuscata), en dyremodell med lignende Holme Biology til mennesker11,12. I denne protokollen analyseres 15 macaque holmer per brønn. I våre hender, 15 holmer per brønn produserte høyere Baseline oksygenforbruk enn færre holmer, med robust aktivering og undertrykkelse av åndedrett som svar på Pharmacologic manipulasjon. Vi fremhever fremgangsmåten for å forberede analysen, en effektiv metode for konsekvent lasting av holmer i sentrum av hver brønn, og felles utfordringer når du utfører denne analysen.
Studiet av Holmen oksygenforbruk har tidligere blitt hemmet av sfærisk form av holmer, deres mangel på overholdelse av kultur overflater, og antall holmer kreves per brønn. I denne protokollen fremhever vi effekten av 96-brønnen spheroid mikroplate for å måle Holme oksygenforbruk på et lite antall holmer og demonstrere en teknikk for håndtering og lasting av holmer som er teknisk gjennomførbart og gir konsistent Resultater.
For at holmer skal holde seg til bunnen av mikroplate og vær…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne Vanderbilt High gjennomstrømming screening Core for bruk av deres anlegg, Agilent bioteknologi, Dr. Paul kievit (Oregon Health and Science University) for ikke-menneskelige primater Holme isolasjoner, og Eric Donahue (Vanderbilt University) for å få hjelp med figur 1. J.M.E. ble støttet av NIGMS av National Institutes of Health under tildeling nummer T32GM007347. M.G. ble støttet av NIH/NIDDK (R24DK090964-06) og Department of Veterans Affairs (BX003744).
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |