Análise do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos

Summary

Este protocolo demonstra a medida precisa e reproduzível do consumo de oxigênio em ilhotas pancreáticas de primatas não humanos. As técnicas de carregamento de ilhotas e revestimento da microplaca fornecem uma estrutura para a medição eficiente da respiração em outros tipos de esferóides cultivados.

Abstract

A medição do consumo de oxigênio em aglomerados esferóides de células, como ilhotas pancreáticas ex vivo, tem sido historicamente desafiadora. Demonstramos a medição do consumo de oxigênio de ilhota usando uma microplaca de 96 poços projetada para a medição do consumo de oxigênio em esferóides. Neste ensaio, as microplacas esferóides são revestidas com um adesivo de células e tecidos no dia anterior ao ensaio. Utilizamos um pequeno volume de solução adesiva para incentivar a adesão ao ilhota apenas ao fundo do poço. No dia do ensaio, 15 ilhotas são carregadas diretamente na base de cada poço usando uma técnica que garante o posicionamento ideal das ilhotas e a medição precisa do consumo de oxigênio. Vários aspectos da respiração mitocondrial são sondados farmacologicamente em ilhotas de primatas não humanos, incluindo respiração dependente de ATP, respiração máxima e vazamento de prótons. Este método permite resultados consistentes e reproduzíveis usando apenas um pequeno número de ilhotas por poço. Teoricamente, pode ser aplicado a quaisquer esferóides cultivados de tamanho semelhante.

Introduction

A fim de manter os níveis normais de glicose no sangue, a célula β pancreática deve sentir elevações na glicose e secretar insulina em conformidade. O acoplamento da secreção de insulina com os níveis de glicose está diretamente ligado ao metabolismo da glicose e à produção de ATP através da fosforia oxidativa mitocondrial. Assim, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no acoplamento de estímulo-secreção¹. Avaliar a função mitocondrial das células β pode revelar defeitos que levam à secreção de insulina prejudicada. A secreção de glucagon por células α pancreáticas também está intimamente ligada à função mitocondrial^2. Embora as linhas imortalizadas da pilha da ilhota tenham provado úteis para alguns tipos de ensaios, a fisiologia destas pilhas não recapitula résível a função inteira da ilhota, como ilustrado pela potentiação do secretion do insulin pelo glucagon^3,4 e pela inibição do secretion do glucagon pelo insulin/somatostatin^5,6 em ilhotas intatas. Isso demonstra a necessidade de medir o consumo de oxigênio usando ilhotas inteiras e intactas.

Técnicas para a medição da respirometria de células ilhotas evoluíram ao longo do tempo, desde o uso de corantes fluorescentes sensíveis ao oxigênio⁷ a sensores de estado sólido que medem diretamente o consumo de oxigênio^8. Inicialmente projetado para monocamada, células aderentes, sistemas de placa de cultura celular comumente usados provaram ser ineficazes para ilhotas pancreáticas. Como as ilhotas não aderem naturalmente aos poços, eles são propensos a serem empurrados para a periferia da cultura, resultando em medição imprecisa do consumo de oxigênio⁹. Para combater esse problema, placas especializadas de 24 poços com uma depressão central que poderia conter ilhotas foram desenvolvidas^9. No entanto, o sistema de placas de 24 poços foi limitado pelo grande número de ilhotas necessárias (50-80 por poço) e pelo número de condições que poderiam ser testadas simultaneamente^10. O recente desenvolvimento de microplacas de 96 poços projetadas especificamente para análise de fluxo extracelular em esferóides superou essas barreiras, permitindo a medição da respirometria de ilhotas com 20 ou menos ilhotas por poço¹⁰.

Aqui, demonstramos o uso deste sistema para medir o consumo de oxigênio em ilhotas do macaco japonês (Macaca fuscata), um modelo animal com biologia de ilhotas semelhante aos seres humanos^11,12. Neste protocolo, 15 ilhotas de macacosão são analisadas por poço. Em nossas mãos, 15 ilhotas por poço produziram maior consumo de oxigênio de base do que menos ilhotas, com ativação robusta e repressão da respiração em resposta à manipulação farmacológica. Destacamos os passos para se preparar para o ensaio, um método eficaz para o carregamento consistente de ilhotas no centro de cada poço, e desafios comuns ao realizar este ensaio.

Protocol

1. Preparação de microplaca e cartucho de sensor no dia anterior à execução do ensaio Ilhotas foram isoladas de três anos de idade macacos japoneses como descrito anteriormente13. Este método é muito semelhante ao usado para isolar ilhotas humanas de doadores de cadáveres, mas difere dos ratos, em que pancreata são muitas vezes inflados com solução de colagem, enquanto o animal está sedação e antes da remoção de órgãos. A recuperação de ilhotas foi re…

Representative Results

Para carregar ilhotas em microplaca, 15 ilhotas devem ser aspiradas em 15 μL de mídia, como mostrado na Figura 1A. As ilhotas estabelecer-se-ão naturalmente para a parte inferior da ponta do pipet dentro de alguns segundos. Em seguida, a ponta do tubo é abaixada para o fundo do poço. A ponta é muito ligeiramente levantada, e um pequeno volume (cerca de 5 μL) é canalizado para fora junto com as ilhotas. Esta técnica resulta em coloca?…

Discussion

O estudo do consumo de oxigênio de ilhotas já foi dificultado pela forma esférica das ilhotas, sua falta de adesão às superfícies culturais e o número de ilhotas exigidas por poço. Neste protocolo, destacamos a eficácia da microplaca esferóide de 96 poços para medir o consumo de oxigênio de ilhotas em um pequeno número de ilhotas e demonstramos uma técnica de manuseio e carregamento de ilhotas que é tecnicamente viável e produz consistente Resultados.

Para que as ilhotas aderem…

Materials

Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL