Análisis del consumo de oxígeno de los islotes pancreáticos no humanos

Summary

Este protocolo demuestra la medición precisa y reproducible del consumo de oxígeno en islotes pancreáticos de primates no humanos. Las técnicas de carga de islos y el recubrimiento de la microplaca proporcionan un marco para la medición eficiente de la respiración en otros tipos de esferoides cultivados.

Abstract

La medición del consumo de oxígeno en grupos esferoides de células, como islotes pancreáticos ex vivo, ha sido históricamente difícil. Demostramos la medición del consumo de oxígeno de los islos utilizando una microplaca de 96 pocillos diseñada para la medición del consumo de oxígeno en esferoides. En este ensayo, las microplacas esferoides están recubiertas con un adhesivo para células y tejidos el día anterior al ensayo. Utilizamos un pequeño volumen de solución adhesiva para fomentar la adherencia del isla solo a la parte inferior del pozo. El día del ensayo, 15 islotes se cargan directamente en la base de cada pozo utilizando una técnica que garantiza un posicionamiento óptimo de los islotes y una medición precisa del consumo de oxígeno. Varios aspectos de la respiración mitocondrial son sondeados farmacológicamente en islotes de primates no humanos, incluyendo respiración dependiente de ATP, respiración máxima y fuga de protones. Este método permite resultados consistentes y reproducibles utilizando sólo un pequeño número de islotes por pozo. Teóricamente se puede aplicar a cualquier esferoides cultivados de tamaño similar.

Introduction

Con el fin de mantener los niveles normales de glucosa en sangre, la célula pancreática debe sentir elevaciones en la glucosa y secretar insulina en consecuencia. El acoplamiento de la secreción de insulina con los niveles de glucosa está directamente relacionado con el metabolismo de la glucosa y la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Por lo tanto, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el acoplamiento estímulo-secreción¹. La evaluación de la función mitocondrial de las células puede revelar defectos que conducen a una secreción de insulina deteriorada. La secreción de glucagón por células pancreáticas también está estrechamente ligada a la función mitocondrial². Aunque las líneas celulares de islotes inmortalizadas han demostrado ser útiles para algunos tipos de ensayos, la fisiología de estas células no recapitula con precisión la función de islotes enteros, como lo ilustra la potenciación de la secreción de insulina por glucagón^3,4 y la inhibición de la secreción de glucagón por insulina/somatostatina^5,6 en islotes intactos. Esto demuestra la necesidad de medir el consumo de oxígeno utilizando islotes enteros e intactos.

Las técnicas para la medición de la respirometría de células de islotes han evolucionado con el tiempo, desde el uso de colorantes fluorescentes sensibles al oxígeno⁷ hasta sensores de estado sólido que miden directamente el consumo de oxígeno⁸. Inicialmente diseñadopara células monocapa y adherentes, los sistemas de placas de cultivo celular comúnmente utilizados han demostrado ser ineficaces para los islotes pancreáticos. Como los islotes no se adhieren naturalmente a los pozos, son propensos a ser empujados a la periferia del cultivo bien resultando en una medición inexacta del consumo de oxígeno⁹. Para combatir este problema, se desarrollaron placas especializadas de 24 pocillos con una depresión central que podría contener islotes^9. Sin embargo, el sistema de placas de 24 pocillos estaba limitado por el gran número de islotes requeridos (50-80 por pozo) y el número de condiciones que se podían probar simultáneamente¹⁰. El reciente desarrollo de microplacas de 96 pocillos diseñadas específicamente para el análisis de flujo extracelular en esferoides ha superado estas barreras, permitiendo la medición de la respirometría de islotes con 20 o menos islotes por pozo^10.

Aquí, demostramos el uso de este sistema para medir el consumo de oxígeno en los islotes del macaco japonés (Macaca fuscata), un modelo animal con biología de islotes similar a los humanos^11,12. En este protocolo, se analizan 15 islotes macacos por pozo. En nuestras manos, 15 islotes por pozo produjeron un mayor consumo de oxígeno basal que menos islotes, con activación robusta y represión de la respiración en respuesta a la manipulación farmacológica. Destacamos los pasos para prepararnos para el ensayo, un método eficaz para la carga constante de islotes en el centro de cada pozo, y desafíos comunes al realizar este ensayo.

Protocol

1. Preparación de microplacas y cartuchos de sensores el día antes de ejecutar el ensayo Los islotes fueron aislados de macacos japoneses de tres años como se describió anteriormente13. Este método es muy similar al utilizado para aislar los islotes humanos de los donantes de cadáveres, pero difiere de los ratones, en los que la páncreata a menudo se infla con solución de colagenasa mientras el animal está bajo sedación y antes de la extracción de órganos. La …

Representative Results

Para cargar islotes en microplacas, se deben aspirar 15 islotes en 15 ml de medios, como se muestra en la Figura 1A. Los islotes se asentarán naturalmente hacia la parte inferior de la punta del pipeteo en pocos segundos. Luego, la punta de la tubería se baja a la parte inferior del pozo. La punta se levanta ligeramente, y un pequeño volumen (alrededor de 5 ollos) se pipetea junto con los islotes. Esta técnica da como resultado la colocac…

Discussion

El estudio del consumo de oxígeno de los islotes se ha visto obstaculizado anteriormente por la forma esférica de los islotes, su falta de adherencia a las superficies de cultivo y el número de islotes requeridos por pozo. En este protocolo, destacamos la eficacia de la microplaca esferoide de 96 pocillos para medir el consumo de oxígeno de los islotes en un pequeño número de islotes y demostramos una técnica para manipular y cargar islotes que es técnicamente factible y produce Resultados.

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Materials

Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL