Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens
Summary
Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.
Abstract
RNA-uitschakeling is een evolutionair geconserveerd, sequentiespecifiek genregulatiemechanisme in eukaryoten. Verschillende plantenpathogenen hebben eiwitten ontwikkeld met de mogelijkheid om de gastheer plant RNA uitschakeling pad remmen. In tegenstelling tot virus effector eiwitten, slechts een aantal uitgescheiden effector eiwitten hebben aangetoond dat de mogelijkheid om RNA-uitschakeling te onderdrukken in bacteriële, oomycete, en schimmelpathogenen, en de moleculaire functies van de meeste effectors blijven grotendeels onbekend. Hier beschrijven we in detail een enigszins gewijzigde versie van de co-infiltratietest die kan dienen als een algemene methode voor het observeren van RNA-uitschakeling en voor het karakteriseren van effector-eiwitten die worden afgescheiden door plantaardige pathogenen. De belangrijkste stappen van de aanpak zijn het kiezen van de gezonde en volledig ontwikkelde bladeren, het aanpassen van de bacteriecultuur aan de juiste optische dichtheid (OD) op 600 nm, en het observeren van groene fluorescerende eiwitten (GFP) fluorescentie op het optimale moment op de geïnfiltreerd bladeren om te voorkomen dat effectoren met een zwakke onderdrukkingsactiviteit worden weggenomen. Dit verbeterde protocol zal bijdragen aan een snelle, nauwkeurige en uitgebreide screening van RNA-uitschakelingssuppressors en dient als een uitstekend uitgangspunt voor het onderzoeken van de moleculaire functies van deze eiwitten.
Introduction
In de afgelopen twee decennia heeft versnelling van genoomsequencing van micro-organismen die plantenziekten veroorzaken geleid tot een steeds grotere kenniskloof tussen sequentie-informatie en de biologische functies van gecodeerde eiwitten1. Onder de moleculen onthuld door sequencing projecten zijn effector moleculen die aangeboren immuniteit te onderdrukken en te vergemakkelijken gastheer kolonisatie; deze factoren worden afgescheiden door destructieve plantenpathogenen, waaronder bacteriën, aaltjes en filamenteuze microben. Om op deze bedreigingen te reageren, hebben waardplanten nieuwe receptoren ontwikkeld die deze effectoren herkennen, waardoor herstel van de immuunrespons mogelijk is. Effectoren zijn dus onderhevig aan verschillende selectieve druk, wat leidt tot diversificatie van effectorrepertoires onder pathogene lijnen2. In de afgelopen jaren is aangetoond dat putatieve effectoren van plantenpathogenen de immuniteit van planteningeboren en ontkracht door druk te maken tot cellulaire processen van de gastheer om de microben op verschillende manieren ten goede te komen, waaronder dysregulatie van signaleringstrajecten, transcriptie, intracellulair vervoer, cytoskeletstabiliteit, blaashandel en RNA-uitschakeling3,4,5. De overgrote meerderheid van de pathogene effectoren, met name die van filamenteuze ziekteverwekkers, is echter raadselachtig gebleven.
RNA-uitschakeling is een homologie-gemedieerde geninactivatiemachines die worden bewaard onder eukaryoten. Het proces wordt geactiveerd door lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) en richt zich op het homologe single-stranded RNA (ssRNA) op een sequentiespecifieke manier, en het manipuleert een breed scala aan biologische processen, waaronder antivirale verdediging6. Om aangeboren immuunreacties van de gastheer te overwinnen, zijn sommige virussen geëvolueerd om RNA-uitschakeling te compenseren, inclusief de mogelijkheid om te repliceren in intracellulaire compartimenten of te ontsnappen aan het gereorganiseerde signaal. Niettemin is de meest algemene strategie waarmee virussen hun genoom beschermen tegen RNA-uitschakelingsafhankelijk verlies van genfunctie, het coderen van specifieke eiwitten die RNA-uitschakelingonderdrukken 7,8. Verschillende benaderingen zijn vastgesteld om virale suppressors van RNA-uitschakeling (VSRs) te screenen en te karakteriseren, waaronder de co-infiltratie van Agrobacterium tumefaciens culturen, transgene planten die putatieve suppressors, enting en celcultuur9,10,11,12,13.
Elk van deze tests heeft voor- en nadelen, en identificeert VSRs op zijn eigen verschillende manier. Een van de meest voorkomende benaderingen is gebaseerd op de co-infiltratie van individuele A. tmuefaciens culturen herbergen de potentiële virale eiwit en een reporter gen (typisch groene fluorescerende eiwit [GFP]) op de Nicotiana benthamiana 16c planten constitutief uitdrukken GFP onder de controle van de bloemkool mozaïek virus 35S promotor. Bij afwezigheid van een actieve virale uitschakelingsuppressor wordt GFP door de gastheercellen als exogene geïdentificeerd en wordt het binnen 3 dagen na infiltratie het zwijgen opgelegd (dpi). Als het virale eiwit daarentegen onderdrukkingsactiviteit bezit, blijft het expressieniveau van GFP stabiel boven 3−9 dpi9. Deze co-infiltratie test is eenvoudig en snel; het is echter niet zeer stabiel of gevoelig. Niettemin heeft de test tal van VSR’s geïdentificeerd met diverse eiwitsequenties en structuren in veel RNA-virussen7,8.
Onlangs zijn verschillende effector eiwitten die de cellulaire RNA-uitschakelingsactiviteit kunnen remmen, gekenmerkt door bacteriële, oomycete- en schimmelplantenpathogenen14,15,16. Deze bevindingen impliceren dat RNA-uitschakelingsonderdrukking een gemeenschappelijke strategie is voor het vergemakkelijken van infectie die door ziekteverwekkers in de meeste koninkrijken wordt gebruikt. In theorie zouden veel, zo niet alle, van de effectoren RNA-uitschakelingsonderdrukkenden (RSS’en) kunnen coderen; tot op heden zijn er echter slechts enkele geïdentificeerd, voornamelijk als gevolg van het tekort aan de betrouwbare en algemene screeningstrategie. Bovendien zijn suppressors van RNA-uitschakeling niet onderzocht in de overgrote meerderheid van de plantenpathogenen17.
In dit rapport presenteren we een geoptimaliseerd en algemeen protocol voor het identificeren van plantenpathogene effectoren die lokale en systemische RNA-uitschakeling kunnen onderdrukken met behulp van de agro-infiltratietest. Het belangrijkste doel van deze studie was om de belangrijkste aspecten van het protocol te benadrukken en de stappen in detail te beschrijven, waardoor een screeningtest werd verstrekt die geschikt is voor bijna alle effectoren van plantenpathogenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-uitschakeling is een belangrijk afweermechanisme dat door planten wordt gebruikt om virale, bacteriële, oomycete- en schimmelpathogenen te bestrijden. Op hun beurt hebben deze microben ontwikkeld uitschakeling suppressor eiwitten tegen te gaan antivirale uitschakeling, en deze RSSs interfereren met verschillende stappen van de RNA silencing pad22,23. Verschillende screeningtests zijn ontwikkeld om RSSs te identificeren10.
<p class…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het “Shuguang Program” van Shanghai Education Development Foundation en Shanghai Municipal Education Commission, het National Key Research and Development Program van China National Key R & D Program of China ( 2018YFD0201500), de National Natural Science Foundation of China (nr. 31571696 en 31660510), het Thousand Talents Program for Young Professionals of China, en de Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
Riferimenti
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
