Dépistage et identification des suppresseurs de silençage de l'ARN des agents d'effets sécrétés des pathogènes végétaux
Summary
Ici, nous présentons une méthode de criblage modifiée qui peut être employée intensivement pour examiner rapidement des suppresseurs de silençage d’ARN dans les agents pathogènes de plante.
Abstract
Le silençage de l’ARN est un mécanisme de régulation génétique spécifique à la séquence conservé par évolution chez les eucaryotes. Plusieurs pathogènes végétaux ont développé des protéines avec la capacité d’inhiber la voie de silençage de l’ARN de la plante hôte. À la différence des protéines d’effecteur de virus, seulement plusieurs protéines d’effectrice sécrétées ont montré la capacité de supprimer le silençage d’ARN dans les agents pathogènes bactériens, de oomycète, et de fongique, et les fonctions moléculaires de la plupart des effecteurs restent largement inconnues. Ici, nous décrivons en détail une version légèrement modifiée de l’assay de co-infiltration qui pourrait servir de méthode générale pour observer le silençage d’ARN et pour caractériser des protéines effectorssées par des pathogènes végétaux. Les étapes clés de l’approche sont le choix des feuilles saines et entièrement développées, l’ajustement de la culture bactérienne à la densité optique appropriée (OD) à 600 nm, et l’observation de la fluorescence des protéines fluorescentes vertes (GFP) au moment optimal sur l’infiltré pour éviter d’omettre les effecteurs ayant une faible activité de suppression. Ce protocole amélioré contribuera à un dépistage rapide, précis et étendu des suppresseurs de silençage de l’ARN et servira d’excellent point de départ pour étudier les fonctions moléculaires de ces protéines.
Introduction
Au cours des deux dernières décennies, l’accélération du séquençage du génome des micro-organismes qui causent les maladies des plantes a conduit à un écart de connaissances de plus en plus important entre l’information sur la séquence et les fonctions biologiques des protéines codées1. Parmi les molécules révélées par les projets de séquençage sont des molécules effectrices qui suppriment l’immunité innée et facilitent la colonisation de l’hôte; ces facteurs sont sécrétés par des agents pathogènes végétaux destructeurs, y compris les bactéries, les nématodes et les microbes filamenteux. Pour répondre à ces menaces, les plantes hôtes ont développé de nouveaux récepteurs qui reconnaissent ces effecteurs, permettant la restauration de la réponse immunitaire. Par conséquent, les effecteurs sont soumis à diverses pressions sélectives, ce qui conduit à la diversification des répertoires effecteurs parmi les lignées pathogènes2. Ces dernières années, il a été démontré que les effecteurs putatifs des pathogènes végétaux perturbent l’immunité innée des plantes en empêchant les processus cellulaires de l’hôte de bénéficier aux microbes de diverses façons, y compris la dysrégulation des voies de signalisation, la transcription, le transport intracellulaire, la stabilité du cytosquelette, le trafic de vésicules et le silençage de l’ARN3,4,5. Cependant, la grande majorité des effecteurs pathogènes, en particulier ceux des agents pathogènes filamenteux, sont restés énigmatiques.
Le silençage de l’ARN est une machinerie d’inactivation génique médiée par l’homologie qui est conservée chez les eucaryotes. Le processus est déclenché par de longs ARN à double brin (dsRNA) et cible l’ARN homologue à brin unique (ARS) d’une manière spécifique à la séquence, et il manipule un large éventail de processus biologiques, y compris la défense antivirale6. Pour surmonter les réponses immunitaires innées de l’hôte, certains virus ont évolué pour compenser le silençage de l’ARN, y compris la capacité de se répliquer à l’intérieur des compartiments intracellulaires ou de s’échapper du signal réorganisé au silençage. Néanmoins, la stratégie la plus générale par laquelle les virus protègent leurs génomes contre la perte dépendante du silençage de l’ARN de la fonction génique est d’encoder des protéines spécifiques qui suppriment le silençage de l’ARN7,8. Plusieurs approches mécanistes différentes ont été établies pour dépister et caractériser les suppresseurs viraux du silençage de l’ARN (RsS), y compris la co-infiltration des cultures tumefaciens Agrobacterium, les plantes transgéniques exprimant les suppresseurs putatifs, la greffe et la culture cellulaire9,10,11,12,13.
Chacun de ces essais présente des avantages et des inconvénients et identifie les RsV de façon distincte. L’une des approches les plus courantes est basée sur la co-infiltration de cultures individuelles A. tmuefaciens hébergeant la protéine virale potentielle et un gène reporter (protéine fluorescente typiquement verte [GFP]) sur les plantes Nicotiana benthamiana 16c exprimant constitutivement GFP sous le contrôle du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S promoteur. En l’absence d’un suppresseur de silençage viral actif, le GFP est identifié comme exogène par les cellules hôtes et est réduit au silence dans les 3 jours suivant l’infiltration (dpi). En revanche, si la protéine virale possède une activité de suppression, le niveau d’expression du GFP reste stable au-delà de 3 à 9 dpi9. Ce test de co-infiltration est simple et rapide; cependant, il n’est ni très stable ni sensible. Néanmoins, l’assay a identifié de nombreux RsV avec diverses séquences et structures de protéines dans de nombreux virus de l’ARN7,8.
Récemment, plusieurs protéines effectrices qui peuvent inhiber l’activité de silençage de l’ARN cellulaire ont été caractérisées par des pathogènes bactériens, oomycètes et plantes fongiques14,15,16. Ces résultats impliquent que la suppression de silençage d’ARN est une stratégie commune pour faciliter l’infection qui est employée par des agents pathogènes dans la plupart des royaumes. En théorie, beaucoup, sinon tous, des effecteurs pourraient encoder suppresseurs de silençage d’ARN (RSSs); à ce jour, cependant, seuls quelques-uns ont été identifiés, principalement en raison de la pénurie de la stratégie de dépistage fiable et générale. En outre, les suppresseurs du silençage d’ARN n’ont pas été étudiés dans la grande majorité des pathogènes végétaux17.
Dans ce rapport, nous présentons un protocole optimisé et général pour identifier les effecteurs d’agents pathogènes végétaux qui peuvent supprimer le silençage local et systémique d’ARN utilisant l’analyse d’agro-infiltration. L’objectif principal de cette étude était de mettre l’accent sur les aspects clés du protocole et de décrire les étapes en détail, fournissant ainsi un test de dépistage qui convient à presque tous les effecteurs d’agents pathogènes végétaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le silençage de l’ARN est un mécanisme de défense clé utilisé par les plantes pour lutter contre les agents pathogènes viraux, bactériens, oomycètes et fongiques. À leur tour, ces microbes ont évolué des protéines suppressrices de silençage pour contrecarrer le silençage antiviral, et ces RSS interfèrent avec différentes étapes de la voie de silençage de l’ARN22,23. Plusieurs tests de dépistage ont été élaborés pour identifier les RSS<sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du « Programme Shuguang » de la Shanghai Education Development Foundation et de la Shanghai Municipal Education Commission, le National Key Research and Development Program of China National Key R-D Program of China ( 2018YFD0201500), la National Natural Science Foundation of China (no. 31571696 et 31660510), le Programme des Mille Talents pour les Jeunes Professionnels de Chine et la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (18DZ22660500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
Riferimenti
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