Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen
Summary
Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.
Abstract
RNA-Silencing ist ein evolutionär konservierter, sequenzspezifischer Genregulationsmechanismus in Eukaryoten. Mehrere Pflanzenpathogene haben Proteine entwickelt, die die Fähigkeit hemmen können, den RNA-Silencing-Signalweg der Wirtspflanze zu hemmen. Im Gegensatz zu Viruseffektorproteinen haben nur mehrere abgesonderte Effektorproteine die Fähigkeit gezeigt, DAS RNA-Silencing bei bakteriellen, Oomyceten- und Pilzpathogenen zu unterdrücken, und die molekularen Funktionen der meisten Effektoren bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir detailliert eine leicht modifizierte Version des Co-Infiltrations-Assays, die als allgemeine Methode zur Beobachtung des RNA-Silencings und zur Charakterisierung von Effektorproteinen dienen könnte, die durch Pflanzenpathogene abgesondert werden. Die wichtigsten Schritte des Ansatzes sind die Wahl der gesunden und voll entwickelten Blätter, die Anpassung der Bakterienkultur an die entsprechende optische Dichte (OD) bei 600 nm und die Beobachtung der Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP) zur optimalen Zeit auf der infiltrierten um das Auslassen von Effektoren mit schwacher Unterdrückungsaktivität zu vermeiden. Dieses verbesserte Protokoll wird zu einem schnellen, genauen und umfassenden Screening von RNA-Silencing-Suppressoren beitragen und als hervorragender Ausgangspunkt für die Untersuchung der molekularen Funktionen dieser Proteine dienen.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Beschleunigung der Genomsequenzierung von Mikroorganismen, die Pflanzenkrankheiten verursachen, zu einer immer größeren Wissenslücke zwischen Sequenzinformationen und den biologischen Funktionen kodierter Proteinegeführt 1. Unter den Molekülen, die durch Sequenzierungsprojekte enthüllt werden, sind Effektormoleküle, die angeborene Immunität unterdrücken und die Wirtskolonisierung erleichtern; diese Faktoren werden durch zerstörerische Pflanzenpathogene, einschließlich Bakterien, Nematoden und fadenförmige Mikroben, abgesondert. Um auf diese Bedrohungen zu reagieren, haben Wirtspflanzen neuartige Rezeptoren entwickelt, die diese Effektoren erkennen und die Wiederherstellung der Immunantwort ermöglichen. Daher unterliegen Effektoren verschiedenen selektiven Drücken, was zu einer Diversifizierung des Effektorrepertoires zwischen pathogenen Linien2führt. In den letzten Jahren haben vermeintliche Effektoren von Pflanzenpathogenen gezeigt, dass sie die angeborene Pflanzenimmunität stören, indem sie die zellulären Wirtsprozesse behindern, um den Mikroben auf verschiedene Weise zu nützen, einschließlich Dysregulation von Signalwegen, Transkription, intrazellulärer Transport, Zytoskelettstabilität, Vesikelhandel und RNA-Silencing3,4,5. Die überwiegende Mehrheit der Pathogen-Effektoren, insbesondere solche von fadenförmigen Krankheitserregern, sind jedoch rätselhaft geblieben.
RNA-Silencing ist eine homologievermittelte Geninaktivierungsmaschinerie, die unter Eukaryoten konserviert wird. Der Prozess wird durch lange doppelsträngige RNA (dsRNA) ausgelöst und zielt sequenzspezifisch auf die homologe einsträngige RNA (ssRNA) ab und manipuliert eine Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich antiviraler Abwehr6. Um angeborene Immunantworten des Wirts zu überwinden, haben sich einige Viren entwickelt, um das RNA-Silencing auszugleichen, einschließlich der Fähigkeit, sich innerhalb intrazellulärer Kompartimente zu replizieren oder dem reorganisierten Signal des Stummschaltungs zu entkommen. Die allgemeinste Strategie, mit der Viren ihre Genome vor dem RNA-Silencing-abhängigen Verlust der Genfunktion schützen, besteht jedoch darin, bestimmte Proteine zu kodieren, die die RNA-Silencing7,8unterdrücken. Es wurden mehrere mechanistisch unterschiedliche Ansätze zur Abschirmung und Charakterisierung viraler Suppressoren von RNA-Silencing (VSRs) etabliert, einschließlich der Ko-Infiltration von Agrobacterium-Tumefaciens-Kulturen, transgenen Pflanzen, die vermeintliche Unterdrücker ausdrücken, Pfropfen und Zellkultur9,10,11,12,13.
Jeder dieser Assays hat Vor- und Nachteile und identifiziert VSRs auf seine eigene Weise. Einer der häufigsten Ansätze basiert auf der Ko-Infiltration einzelner A. tmuefaciens-Kulturen, die das potentielle virale Protein und ein Reportergen (typisch grünes fluoreszierendes Protein [GFP]) auf den Nicotiana benthamiana 16c-Pflanzen beherbergen, die GFP unter der Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotors konstitutiv ausdrücken. In Ermangelung eines aktiven viralen Silencing Suppressors wird GFP von den Wirtszellen als exogen identifiziert und innerhalb von 3 Tagen nach der Infiltration (dpi) zum Schweigen gebracht. Im Gegensatz dazu, wenn das virale Protein Unterdrückungsaktivität besitzt, bleibt der Expressionsgrad von GFP stabil über 3-9 dpi9. Dieser Co-Infiltrationstest ist einfach und schnell; es ist jedoch weder sehr stabil noch empfindlich. Nichtsdestotrotz hat der Assay zahlreiche VSRs mit unterschiedlichen Proteinsequenzen und Strukturen in vielen RNA-Virenidentifiziert 7,8.
Kürzlich wurden mehrere Effektorproteine, die die zelluläre RNA-Silencing-Aktivität hemmen können, durch bakterielle, Oomycete und Pilzpflanzenpathogene14,15,16charakterisiert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RNA-Silencing-Unterdrückung eine gemeinsame Strategie zur Erleichterung der Infektion ist, die von Krankheitserregern in den meisten Königreichen verwendet wird. Theoretisch könnten viele, wenn nicht alle Der Effektoren RNA-Silencing Suppressoren (RSS) kodieren; Bisher wurden jedoch nur wenige identifiziert, was vor allem auf den Mangel an zuverlässiger und allgemeiner Screening-Strategie zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurden die Unterdrücker von RNA-Silencing bei der überwiegenden Mehrheit der Pflanzenpathogene17nicht untersucht.
In diesem Bericht stellen wir ein optimiertes und allgemeines Protokoll zur Identifizierung von Pflanzenpathogeneffektoren vor, die lokale und systemische RNA-Silencing mittels agroinfiltrations-Assay unterdrücken können. Das oberste Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten Aspekte des Protokolls hervorzuheben und die Schritte detailliert zu beschreiben, wodurch ein Screening-Test durchgeführt wird, der für fast alle Effektoren von Pflanzenpathogenen geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA-Silencing ist ein wichtiger Abwehrmechanismus, der von Pflanzen eingesetzt wird, um virale, bakterielle, Oomycete- und Pilzkrankheitserreger zu bekämpfen. Im Gegenzug haben diese Mikroben Silencing-Suppressor-Proteine entwickelt, um antiviralen Silencing entgegenzuwirken, und diese RSS stören verschiedene Schritte des RNA-Silencing-Signalwegs22,23. Zur Identifizierung von RSSs10wurden mehrere Screening-Assays entwickelt.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des “Shuguang Program” der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission, des National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31571696 und 31660510), das Thousand Talents Program for Young Professionals of China und die Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
Riferimenti
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