Combiner des dispositifs fluides avec la microscopie et la cytométrie de débit pour étudier le transport microbien dans les médias poreux à travers les échelles spatiales
Summary
Les courbes révolutionnaires sont des outils efficaces pour étudier le transport des bactéries dans les médias poreux. Ici, nous introduisons des outils basés sur des dispositifs fluidiques en combinaison avec la microscopie et le comptage cytométrique de flux pour obtenir des BTCs.
Abstract
Comprendre le transport, la dispersion et le dépôt des micro-organismes dans les milieux poreux est une tâche scientifique complexe comprenant des sujets aussi divers que l’hydrodynamique, l’écologie et l’ingénierie environnementale. La modélisation du transport bactérien dans des environnements poreux à différentes échelles spatiales est essentielle pour mieux prévoir les conséquences du transport bactérien, mais les modèles actuels ne parviennent souvent pas à se mettre à l’échelle des conditions de laboratoire à des conditions sur le terrain. Ici, nous introduisons des outils expérimentaux pour étudier le transport bactérien dans les médias poreux à deux échelles spatiales. L’objectif de ces outils est d’obtenir des observables macroscopiques (comme des courbes révolutionnaires ou des profils de dépôt) de bactéries injectées dans des matrices poreuses transparentes. À petite échelle (10-1000 μm), les dispositifs microfluidiques sont combinés avec la vidéo-microscopie optique et le traitement d’image pour obtenir des courbes révolutionnaires et, en même temps, pour suivre les cellules bactériennes individuelles à l’échelle des pores. À plus grande échelle, la cytométrie d’écoulement est combinée avec un distributeur robotique self-made pour obtenir des courbes révolutionnaires. Nous montrons l’utilité de ces outils pour mieux comprendre comment les bactéries sont transportées dans des médias poreux complexes tels que la zone hyporhéique des cours d’eau. Comme ces outils fournissent des mesures simultanées à travers les échelles, ils ouvrent la voie à des modèles basés sur des mécanismes, d’une importance cruciale pour le haut de gamme. L’application de ces outils peut non seulement contribuer au développement de nouvelles applications de bioremédiation, mais aussi jeter un nouvel éclairage sur les stratégies écologiques des micro-organismes colonisant les substrats poreux.
Introduction
Les études visant à comprendre le transport des microbes à travers les médias poreux ont principalement été motivées par des préoccupations de contamination1, la transmission de lamaladie 2 et la biorémédiation3. À cet égard, les bactéries ont surtout été traitées comme des particules dans les modèles de transport4 et des processus tels que la filtration, la tension, le décantation gravitationnelle ou la remobilisation à partir de biofilms ont été identifiés comme des moteurs de rétention ou de transport des microbes5. Toutefois, l’étude du transport des bactéries à travers les paysages poreux peut également nous renseigner sur les stratégies écologiques qui sous-tendent leur succès dans ces environnements complexes. Pourtant, cela nécessite de nouvelles expériences et des modèles mathématiques fonctionnant au niveau de la cellule unique, de la population ou de la communauté microbienne.
Les milieux poreux naturels, tels que ceux que l’on trouve dans la zone hyporhéique des cours d’eau et des rivières, sont densément colonisés par diverses communautés de microbes formant des biofilms6. Les biofilms forment des structures qui modifient le flux et donc le transport et la dispersion des bactéries dans la phaseliquide 7,8. Le transport des bactéries à l’échelle des pores dépend de la disponibilité limitée de l’espace dans la matrice poreuse et la dispersion liée à la motilité peut être un moyen efficace d’augmenter la condition physique individuelle grâce à une concurrence réduite pour les ressources dans les zones moins densément peuplées. D’autre part, les bactéries motiles peuvent également atteindre des régions plus isolées de la matrice poreuse et l’exploration prolongée de ces zones peut offrir des possibilités écologiques aux populationsmotiles 10. À de plus grandes échelles spatiales, la croissance des biofilms détourne les trajectoires d’écoulement, ce qui entraîne également un obstruement (partiel) des pores et, par conséquent, l’établissement de conditions d’écoulement encore plus canalisées ethétérogènes11. Cela a des conséquences sur l’approvisionnement en éléments nutritifs et la capacité de dispersion, la fréquence et la distance. Le flux préférentiel, par exemple, peut générer ce qu’on appelle des « voies rapides » et les bactéries motiles peuvent atteindre des vitesses encore plus élevées que le débit local le long de cesvoies 12. Il s’agit d’un moyen efficace d’accroître l’exploration de nouveaux habitats.
Une variété d’outils se servent pour l’étude du transport des bactéries motiles et non motiles (et des particules) dans les médias poreux. Les modèles numériques ont de grandes capacités prédictives importantes pour les applications, mais sont souvent limités par des hypothèsesinhérentes 4. Les expériences àl’échelle de laboratoire 13,14 combinées à la modélisation révolutionnaire de la courbe (BTC) ont fourni des aperçus importants de l’importance des propriétés bactériennes de surface cellulaire pour collerl’efficacité 15. En règle générale, les CTC (c.-à-d. séries de temps de concentration de particules à un endroit fixe) sont obtenus au moyen de rejets à taux constant et de la mesure des nombres cellulaires à l’extérieur du dispositif expérimental. Dans ce contexte, les BTC reflètent la dynamique d’advection-dispersion des bactéries dans la matrice poreuse et peuvent être prolongés par un terme d’évier tenant compte de l’attachement. Toutefois, la modélisation des CTC à elle seule ne résout pas le rôle de l’organisation spatiale du substrat poreux ou du biofilm pour les processus de transport. Il a été prouvé que d’autres observables macroscopiques comme les profils de dispersion ou de dépôt fournissent des informations importantes sur la distribution spatiale ou les particules retenues ou les communautés en croissance. La microfluidique est une technologie qui permet d’étudier le transport dans les médias poreux par microscopieenquête 9,12,16, et à l’exception d’un travail récent10, les systèmes expérimentaux sont généralement limités à une seule échelle de longueur de résolution, c’est-à-dire l’échelle pore ou l’échelle de l’appareil fluide ensemble.
Ici, nous introduisons une série de méthodes combinées pour étudier le transport des bactéries motiles et non motiles dans les paysages poreux à différentes échelles. Nous combinons les observations du transport bactérien à l’échelle des pores avec des informations à plus grande échelle, au moyen d’une analyse BTC. Les dispositifs microfluidiques construits à partir de lithographie douce à l’aide de polydimethylsiloxane (PDMS) sont biocompatibles, résistants à une gamme de produits chimiques, permettent une réplicabilité à faible coût et offrent une excellente transparence optique ainsi qu’une faible autofluorescence critique pour l’observation microscopique. Les microfluidiques basés sur le PDMS ont déjà été utilisés pour étudier le transport des microbes dans des canaux simples17 ou dans des géométries plus complexes12. Toutefois, les expériences typiquement microfluidiques se concentrent sur des horizons à court terme et l’observation microscopique d’épi fluorescence des cellules vivantes est généralement limitée aux souches génétiquement modifiées (p. ex., souches étiquetées GFP). Nous présentons ici des outils pour étudier le transport bactérien à l’aide d’appareils microfluidiques à base de PDMS en combinaison avec la microscopie et les dispositifs plus grands fabriqués à partir de poly(méthyle méthacrylate) (PMMA, également connu sous le nom de plexiglas) en combinaison avec la cytométrie du flux. Pdms et PMMA diffèrent dans la perméabilité du gaz et les propriétés de surface, offrant ainsi des possibilités complémentaires d’étudier le transport bactérien. Bien que le dispositif microfluidique offre un environnement plus contrôlé, le dispositif plus grand permet des expériences sur de longues périodes de temps ou en utilisant des communautés bactériennes naturelles. Le comptage par microscopie à haute résolution temporelle dans une zone dédiée est utilisé pour obtenir le BTC dans le dispositif microfluidique à base de PDMS. Pour obtenir le nombre de cellules pour la modélisation BTC à partir de l’appareil à base de PMMA, nous introduisons un distributeur automatique de liquide auto-construit en combinaison avec la cytométrie d’écoulement. Dans cette configuration, les cellules passent le dispositif fluidique et sont consécutivement distribuées dans 96 plaques de puits. La résolution temporelle est limitée par le volume minimum qui peut être distribué avec précision et donc le débit moyen à travers le dispositif fluide. Fixatif dans les puits empêche la croissance et facilite la coloration de l’ADN pour l’énumération en aval du débit cytométrique. Pour prévenir la croissance bactérienne pendant les expériences de transport, nous utilisons un milieu minimal (appelé tampon de motilité).
Étant donné que les protocoles de préparation des dispositifs fluidiques à différentes échelles sont facilement disponibles, nous n’introduisons que brièvement les techniques de production de tels dispositifs et nous nous concentrons plutôt sur les procédures expérimentales d’enregistrement des CFC. De même, diverses routines existent pour l’énumération cytométrique du flux des microbes et les utilisateurs ont besoin de connaissances spécialisées pour interpréter les résultats obtenus par cytométrie de flux. Nous rapportons l’utilisation nouvelle des dispositifs microfluidiques en combination avec la formation image microscopique pour enregistrer des BTCs des cellules fluorescentes-marquées. À l’échelle des pores, les vitesses et trajectoires locales sont obtenues au moyen du traitement d’image. De plus, nous démontrons l’utilisation d’un dispositif fluidique à base de PMMA en combinaison avec le comptage flow-cytométrique pour observer le transport bactérien de cellules motiles et non motiles dans des environnements poreux colonisés par un biofilm de cours d’eau indigène.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous suggérons deux moyens d’étudier le transport des microbes à travers des systèmes poreux au niveau d’une seule cellule et au niveau de la population. Bien que l’étude des phénomènes de transport à l’aide de la modélisation BTC ait fourni des informations précieuses sur la propagation des agents pathogènes ou des contaminants à l’échelle de l’écosystème, il existe encore des difficultés à passer des expériences de laboratoire aux conditions sur le terrain. Les outils décrits ici per…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l’aide d’Antoine Wiedmer avec la mise en place du distributeur robotique et le dispenser.py script.
Materials
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
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