עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי
Summary
הפרלציה היא שינוי חשוב בחלבונים היקפיים כריכת ממברנה. תאי חרקים יכולים להיות מניפולציות כדי לייצר farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בכמויות המאפשרות מדידות ביופיזיקלי של חלבון-חלבון ואינטראקציות חלבונים-השומנים
Abstract
הפרלציה חלבון הוא שינוי מפתח האחראי על המיקוד חלבונים כדי ממברנות תאיים. KRAS4b, אשר מוטציה 22% של סרטן האדם, מעובד על ידי פרנוסילציה ו carboxymethylation בשל נוכחותם של ‘ CAAX ‘ מוטיב תיבת ב C-טרמינוס. מערכת baculovirus הנדסה שימש כדי לבטא farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בתאי חרקים ותיאר קודם לכן. כאן, אנו מתארים את האפיון המפורט והמעשי של החלבון. במיוחד, שימשו כרומטוגרפיה של אהדה והחלפת יונים כדי לטהר את החלבון להומוגניות. ספקטרומטר מסה שלם ומקורי שימש לאימות השינוי הנכון של KRAS4b ולאימות מחייב של נוקלאוטיד. לבסוף, האגודה הממברנה של farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b ליפוזומים נמדד באמצעות ספקטרוסקופית תהודה משטח המשטח.
Introduction
שינויי posttranslational ממלאים תפקיד מרכזי בהגדרת הפעילות הפונקציונלית של חלבונים. שינויים כגון זירחון וגליקוציה מבוססים היטב. השינויים השומנים מאופיינים פחות טוב, עם זאת. מעריכים כי ככל 0.5% של כל החלבונים הסלולריים עשויים להיות הסכם1. הפרלציה היא העברה של 15 פחמן farnesyl או 20-פחמן geranylgeranyl שרשרת השומנים לקבלה חלבון המכיל את המוטיב CAAX2. חלבונים מראש היו מעורבים בהתקדמות של מחלות אנושיות מספר כולל הזדקנות מוקדמת3, אלצהיימר4, בתפקוד הלב5, choroideremia6, סרטן7. GTPases קטנים, HRAS, NRAS, ו-קראס1, גרעיני למינציה, ו קינטומטלות cenp-E ו-F הם חלבונים מתחת למצב הבזליים. GTPases קטנים אחרים, כלומר RhoA, Rhoa, Rac1, cdc-42, ו RRAS הם geranylgeranylated ואילו Rhoa יכול להיות farnesylated או Geranylgeranylated9.
GTPase קטן KRAS4b מתפקד כמתג מולקולרי, ביסודו של דבר שידור גורם הגדילה מחילוץ איתות כדי התמרה אות תאיים מסלולים המעוררים צמיחת תאים והתפשטות, באמצעות אינטראקציות חלבונים חלבון מרובים. ישנם שני היבטים מרכזיים של KRAS4b ביוכימיה החיוניים לפעילותה. ראשית, החלבון מחזורי בין התמ ג לא פעיל ומצב פעיל של GTP שבאמצעותו הוא מעורב באופן פעיל עם העריקים. שנית, אזור C-מסוף פולי ליזין ו מעטפת ו carboxyמתילated ציסטאין להפנות את החלבון לקרום פלזמה, המאפשר גיוס והפעלה של מנוכי במורד הזרם. החשבונאי KRAS4b הוא הנהג אונגניים ב הלבלב, המעי הגס, וסרטן הריאות10, וככזה, התערבות טיפולית יהיה יתרון קליני ענק. ייצור של חלבון רקומביננטי שונה באופן אותנטי כי הוא farnesylated ו carboxyמתילמית יהיה לאפשר הקרנה ביוכימית באמצעות KRAS4b בשילוב עם מחליפים ממברנה כגון ליפוזומים או ננודיסקי ליפיד11,12.
Farnesyl טרנספראז (fnt) מזרז את התוספת של farnesyl פירופוספט ל-C-טרמינל ציסטאין במוטיב caax ב KRAS4b. לאחר הפרלציה, החלבון הוא נסחר לרשת האנדופלזמית (ER) שבה האנזים המרה (RCE1) מותיר את שלושת שאריות C-terminal. השלב האחרון בעיבוד הוא מתילציה של משקעים C-terminal החדש של הקרום על ידי חלבון הממברנה ER, isoprenylcysteine מתילגיאז (ICMT). הביטוי של רקומביננטי KRAS4b ב E. coli מביא לייצור של חלבון שלא שונו. ניסיונות קודמים לייצר KRAS4b מעובד הוגבלה בשל התשואות מספיק עבור ניסויים מבניים או תרופות ההקרנה או נכשל לכידה של חלבון בוגר באורך מלא הטבעי13,14. הפרוטוקול המוצג כאן מנצל מהונדסים baculovirus מבוסס תא חרקים מערכת ושיטת טיהור שמייצר מאוד מטוהרים, מעובד באופן מלא KRAS4b בתשואות של 5 מ”ג/L של תרבות התא.
האפיון חלבון זהיר חיוני כדי לאמת את האיכות של חלבונים רקומביננטי לפני היציאה על ביולוגיה מבנית או לימודי סינון סמים. שני פרמטרים מרכזיים של מעובד באופן מלא KRAS4b הם אימות של השינוי הנכון הסכם ואת הזמינות של farnesylated ו carboxyמתילated C-טרמינוס (FMe) לאינטראקציה עם תחליפי ממברנה או שומנים. Electrospray יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS) של KRAS4b-fme שימש כדי למדוד את המשקל המולקולרי ולאשר את הנוכחות של farnesyl ושינויים carboxyמתיל. הספקטרומטר ההמוני היליד, שבו מרססים דגימות באמצעות ממיסים שאינם משפריצו, שימשו כדי להדגים כי KRAS4b-FMe הייתה גם קשורה לקופקטור התמ ג. לבסוף, הספקטרוסקופיית תהודה של פני השטח שימש למדידת הכריכה הישירה של KRAS4b-FMe עם ליפוזומים ללא קיבוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאמור בסעיף תוצאות הנציג, הצעד הקריטי ביותר במהלך הטיהור הוא טיפול במדגם במהלך הזמן שהוא במלח נמוך. הגבלת הזמן שהמדגם נחשף לפחות מ-200 מ”מ והוא יסייע להפחית משקעים ולהגדיל את התשואה למדגם. פענוח תוצאות CEX יכול להיות קשה אם הפרופיל אינו תואם את הציפיות (ראה איור 2). עד שהפרוטוקו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים שיבוט והבעה תמיכה מקאריסה Grose, ג’ן Melhalko, ו מאט דרו במעבדת ביטוי חלבון, פרדריק המעבדה הלאומית לחקר הסרטן. פרויקט זה ממומן במלואו או בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה לא. HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, וגם לא מזכיר שמות מסחריים, מוצרים עסקיים או ארגונים המזכירים אישור ממשלת ארצות הברית
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Riferimenti
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer’s disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
