Fullt behandlet rekombinant KRAS4b: isolere og karakteriserer Farnesylated og denaturert protein
Summary
Prenylation er en viktig modifikasjon på perifere membran bindende proteiner. Insekt celler kan manipuleres til å produsere farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i mengder som muliggjør Biofysiske målinger av protein-protein og protein-lipid interaksjoner
Abstract
Protein prenylation er en viktig modifikasjon som er ansvarlig for å målrette proteiner mot intracellulære membraner. KRAS4b, som er mutert i 22% av menneskelig kreft, behandles av farnesylation og carboxymethylation på grunn av tilstedeværelsen av en ‘ CAAX ‘ boksen motiv på C-Terminus. Et utviklet baculovirus system ble brukt til å uttrykke farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i insekt celler og har blitt beskrevet tidligere. Her beskriver vi den detaljerte, praktiske rensing og biokjemiske karakterisering av proteinet. Spesielt ble affinitet og Ion Exchange kromatografi brukt til å rense proteinet til homogenitet. Intakt og innfødt masse massespektrometri ble brukt til å validere den korrekte modifikasjon av KRAS4b og å verifisere nukleotid binding. Til slutt ble membran sammenslutning av farnesylated og carboxymethylated KRAS4b til liposomer målt ved hjelp av overflate Plasmon resonans spektroskopi.
Introduction
Posttranslational modifikasjoner spiller en nøkkelrolle i å definere funksjonell aktivitet av proteiner. Modifikasjoner som fosforylering og glykosylering er godt etablert. Lipid modifikasjoner er mindre godt karakterisert, men. Det anslås at så mye som 0,5% av alle cellulære proteiner kan være prenylated1. Prenylation er overføring av en 15-karbon farnesylpyrofosfat eller en 20-karbon geranylgeranyl lipid kjede til et Acceptor protein som inneholder CAAX motiv2. Prenylated proteiner har vært innblandet i utviklingen av flere menneskelige sykdommer, inkludert prematur aldring3, Alzheimers4, CARDIAC dysfunksjon5, choroideremia6, og kreft7. De små GTPases, HRAS, NRAS, og KRAS1, Nuclear laminins, og kinetochores CENP-E og F er farnesylated proteiner under basal tilstand. Andre små GTPases, nemlig RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, og RRAS er geranylgeranylated8, mens RhoB kan være farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lille GTPase KRAS4b fungerer som en molekylær bryter, hovedsakelig sender ekstracellulære vekstfaktor signalering for å intracellulære signal Transduction trasé som stimulerer cellevekst og spredning, via flere protein-protein interaksjoner. Det er to viktige aspekter av KRAS4b biokjemi som er avgjørende for sin aktivitet. For det første, proteinet sykluser mellom en inaktiv BNP og en aktiv GTP bundet stat der den aktivt engasjerer med effekt Orer. For det andre, en C-terminal Poly-lysin-regionen og en farnesylated og carboxymethylated cystein direkte proteinet til plasma membranen, slik at rekruttering og aktivering av nedstrøms effekt Orer. Mutant KRAS4b er en kreftfremkallende driver i bukspyttkjertelen, tykk og lungekreft10, og som sådan, terapeutisk intervensjon ville ha en stor klinisk nytte. Produksjon av autentisk modifisert rekombinant protein som er farnesylated og carboxymethylated ville muliggjøre biokjemiske screening ved hjelp av KRAS4b i kombinasjon med membran surrogater som liposomer eller lipid nanodiscs11,12.
Farnesylpyrofosfat glutamyltransferase (FNT) katalyserer tillegg av farnesylpyrofosfat geranylpyrofosfat til C-terminal cystein i CAAX-motivet i KRAS4b. Etter prenylation er proteinet trafikkert til endoplasmatiske retikulum (ER) der RAS omdanner enzymet (RCE1) kløyver de tre C-terminal rester. Det siste trinnet i behandlingen er metylering av den nye C-terminal farnesylcysteine rester av ER membran protein, isoprenylcysteine kar bok syl methyltransferase (ICMT). Uttrykk for rekombinant KRAS4b i E. coli resulterer i produksjon av et uendret protein. Tidligere forsøk på å produsere behandlet KRAS4b har vært begrenset på grunn av utilstrekkelig avkastning for strukturelle eller narkotika screening eksperimenter eller har unnlatt å recapitulate den innfødte full lengde modne protein13,14. Protokollen som presenteres her benytter en konstruert baculovirus-basert insekt celle uttrykk system og rensing metode som genererer svært renset, fullt behandlet KRAS4b ved rentene på 5 mg/L av cellekultur.
Forsiktig protein karakterisering er viktig å validere kvaliteten på rekombinant proteiner før fatt på strukturelle biologi eller narkotika screening studier. To viktige parametre for fullt behandlet KRAS4b er validering av riktig prenyl modifikasjon og tilgjengeligheten av farnesylated og carboxymethylated C-Terminus (FMe) for interaksjon med membran erstatninger eller lipider. Electrospray ionisering masse massespektrometri (ESI-MS) av KRAS4b-FMe ble brukt til å måle molekylvekt og bekrefte tilstedeværelsen av farnesylpyrofosfat og carboxymethyl modifikasjoner. Native masse massespektrometri, der prøvene er sprayet med nondenaturing løsemidler, ble brukt til å demonstrere at KRAS4b-FMe var også bundet til BNP-kofaktor. Til slutt ble overflate Plasmon resonans spektroskopi brukes til å måle direkte binding av KRAS4b-FMe med immobilisert liposomer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som nevnt i representative resultater delen, det mest kritiske trinnet under rensing er håndteringen av prøven i løpet av den tiden det er i lavere salt. Begrense tiden som prøven er utsatt for mindre enn 200 mM NaCl vil bidra til å redusere nedbør og øke sample yield. Tolkning av resultatene av CEX kan være vanskelig hvis profilen ikke samsvarer med forventningene (se figur 2). Inntil protokollen har blitt rutine, er det anbefalt at CEX eluering fraksjoner som ikke er tatt frem lagr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner kloning og uttrykk støtte fra Carissa Grose, Jen Melhalko, og Matt Drew i protein Expression laboratorium, Frederick National laboratorium for Cancer Research. Dette prosjektet har vært finansiert helt eller delvis med Federal midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene eller policyene til Department of Health and Human Services, og heller ikke omtale av varenavn, kommersielle produkter eller organisasjoner innebærer godkjennelse fra amerikanske myndigheter
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Riferimenti
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer’s disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
