Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка
Summary
Пренилирование является важной модификацией периферических мембранных связывающих белков. Клетки насекомых можно манипулировать для производства фарнезилатных и carboxymethylated KRAS4b в количествах, которые позволяют биофизические измерения белково-белковых и белково-липидных взаимодействий
Abstract
Пренилация белка является ключевой модификацией, которая отвечает за таргетинг белков на внутриклеточные мембраны. KRAS4b, который мутирует в 22% рака человека, обрабатывается фарнезиляции и карбоксиметилирования из-за присутствия ‘CAAX’ мотив коробки на C-термину. Инженерная система бакуловируса была использована для выражения фарнезилатовые и carboxymethylated KRAS4b в клетках насекомых и была описана ранее. Здесь мы описываем детальную, практическую очистку и биохимическую характеристику белка. В частности, для очищения белка до однородности использовались сродство и ионная обменная хроматография. Intact и родной масс-спектрометрии был использован для проверки правильной модификации KRAS4b и для проверки нуклеотидных связывания. Наконец, мембранная связь фарнезилатной и карбоксиметилового KRAS4b к липосоме была измерена с помощью поверхностной плазмонрезонансной спектроскопии.
Introduction
Почтовые изменения играют ключевую роль в определении функциональной активности белков. Такие модификации, как фосфорилирование и гликозилирование, хорошо известны. Липидные модификации менее хорошо характеризуются, однако. Подсчитано, что до 0,5% всех клеточных белков могут быть пренилированными1. Prenylation является передача 15-углеродный фарнесил или 20-углеродный геранилгеранил липидной цепи принимает белок, содержащий мотив CAAX2. Пренилированные белки были вовлечены в прогрессирование нескольких заболеваний человека, включая преждевременное старение3, болезнь Альцгеймера4, сердечная дисфункция5,сосудидеремия6, и рак7. Небольшие GTPases, HRAS, NRAS, и KRAS1, ядерные ламинины, и кинетохоры CENP-E и F являются фарнезилатными белками в базальном состоянии. Другие небольшие GTPases, а именно RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, и RRAS являются geranylgeranylated8, в то время как RhoB может быть farnesylated или geranylgeranylated9.
Небольшой GTPase KRAS4b функционирует как молекулярный переключатель, по существу передающий внеклеточный фактор роста, сигнализирующие на внутриклеточные пути трансдукции сигнала, которые стимулируют рост и пролиферацию клеток, через несколько белково-белковых взаимодействий. Есть два ключевых аспекта биохимии KRAS4b, которые имеют важное значение для его деятельности. Во-первых, белковые циклы между неактивным ВВП и активным состоянием связанного GTP, при котором он активно взаимодействует с эффекторами. Во-вторых, C-терминальный поли-лизин области и фарнезилати и карбоксиметилированный цистеин направить белок на плазменной мембраны, что позволяет вербовки и активации вниз по течению эффекторов. Мутант KRAS4b является онкогенным драйвером в поджелудочной железе, колоректальной и рак легких10, и как таковой, терапевтическое вмешательство будет иметь огромное клиническое преимущество. Производство подлинно модифицированного рекомбинантного белка, который фарнезилат и карбоксиметилированный позволит биохимический скрининг с использованием KRAS4b в сочетании с мембранными суррогатами, такими как липосомы или липидные нанодиски11,12.
Фарнесил трансферазы (FNT) катализирует добавление фарнесилового пирофосфата в C-терминал цистеин в мотиве CAAX в KRAS4b. После prenylation, белок торгуется в эндоплазмический ретикулум (ER), где Ras преобразования фермента (RCE1) расщепляет три C-терминалостатка остатков. Последним шагом в обработке является метилирование нового C-терминала фарнесилцистеина остаток мембранного белка ER, isoprenylcysteine carboxyl метилтрансферазы (ICMT). Выражение рекомбинантного KRAS4b в кишечной палочке приводит к выработке неизмененного белка. Предыдущие попытки производить обработанный KRAS4b были ограничены из-за недостаточной урожайности для структурных или наркотиков скрининговых экспериментов или не смогли резюмировать родной полнометражный зрелый белок13,14. В представленном здесь протоколе используется инженерная система экспрессии клеток на основе бакуловируса и метод очистки, который генерирует высокоочищенный, полностью обработанный KRAS4b при урожайности 5 мг/л клеточной культуры.
Тщательная характеристика белка имеет важное значение для проверки качества рекомбинантных белков до начала структурных исследований биологии или скрининга наркотиков. Двумя ключевыми параметрами полностью обработанного KRAS4b являются проверка правильной модификации пренил и наличие фарнезилатной и карбоксиметилированных C-терминов (FMe) для взаимодействия с мембранными заменителями или липидами. Электроспрей ионизация масс-спектрометрии (ESI-MS) KRAS4b-FMe использовалась для измерения молекулярного веса и подтверждения наличия фарнесиловых и карбоксиметиловых модификаций. Местная масс-спектрометрия, где образцы распыляются с неденативными растворителями, была использована для демонстрации того, что KRAS4b-FMe также был связан с его Кофактором ВВП. Наконец, поверхностная плазмонная резонансная спектроскопия использовалась для измерения прямого связывания KRAS4b-FMe с обездвижемыми липосомыми.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как отмечается в разделе «Результаты представителей», наиболее важным шагом при очистке является обработка образца во время его пребывания в более низкой соли. Ограничение времени, в течение которого образец подвергается воздействию менее 200 мМ NaCl, поможет уменьшить количество осадко…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, клонирование и выражение поддержки от Карисса Гроуз, Джен Melhalko, и Мэтт Дрю в лаборатории экспрессии белка, Фредерик Национальной лаборатории по изучению рака. Этот проект был профинансирован в целом или частично за счет федеральных средств из Национального института рака, Национальные институты здравоохранения, в соответствии с контрактом No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Riferimenti
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer’s disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
