KRAS4b recombinante totalmente processado: Isolando e caracterizando a proteína farnesylated e metilada
Summary
A prenimação é uma modificação importante nas proteínas de ligação da membrana periférica. As células de insetos podem ser manipuladas para produzir KRAS4b farnesilado e carboximetilado em quantidades que permitem medições biofísicas de interações proteína-proteína e proteína-lipídios
Abstract
A prenimação proteica é uma modificação fundamental que é responsável pela segmentação de proteínas para membranas intracelulares. Kras4b, que é mutado em 22% dos cânceres humanos, é processado por farnização e carboximetilação devido à presença de um motivo de caixa ‘CAAX’ no C-terminus. Um sistema de baculovírus projetado foi usado para expressar KRAS4b farnesilado e carboximetilado em células de insetos e foi descrito anteriormente. Aqui, descrevemos a purificação detalhada e prática e caracterização bioquímica da proteína. Especificamente, a afinidade e a cromatografia de troca de íons foram usadas para purificar a proteína à homogeneidade. A espectrometria de massa intacta e nativa foi utilizada para validar a modificação correta do KRAS4b e para verificar a ligação do nucleotídeo. Finalmente, a associação da membrana de KRAS4b farnesylated e carboxymethylated aos lipossomos foi medida usando a espectroscopia da ressonância do plasmon de superfície.
Introduction
As modificações pós-translacionais desempenham um papel fundamental na definição da atividade funcional das proteínas. Modificações como fosforilação e glicosilação estão bem estabelecidas. As modificações lipídicas são menos bem caracterizadas, no entanto. Estima-se que até 0,5% de todas as proteínas celulares podem ser pré-nylated1. Prenimação é a transferência de um farnesyl de 15 carbonoou uma cadeia lipídica geranylgeranyl de 20 carbono para uma proteína aceitante contendo o motivo CAAX2. Proteínas pré-lafoladas têm sido implicadas na progressão de várias doenças humanas, incluindo o envelhecimento prematuro3,Alzheimer4,disfunção cardíaca5, choroideremia6, e câncer7. Os pequenos GTPases, HRAS, NRAS e KRAS1,laminados nucleares e as kinetochores CENP-E e F são proteínas farnesilado a condição basal. Outros pequenos GTPases, ou seja, RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 e RRAS são geranylgeranylated8, enquanto RhoB pode ser farnesylated ou geranylgeranylated9.
O pequeno GTPase KRAS4b funciona como um interruptor molecular, essencialmente transmitindo fator de crescimento extracelular sinalizando para vias intracelulares de transdução de sinal que estimulam o crescimento e proliferação de células, através de múltiplas interações proteína-proteína. Existem dois aspectos-chave da bioquímica KRAS4b que são essenciais para a sua atividade. Primeiro, os ciclos de proteína entre um PIB inativo e um estado vinculado ao GTP ativo pelo qual ele se envolve ativamente com efíores. Em segundo lugar, uma região de poliliina terminal C e uma cisteína farnesilado e carboximetilada direcionam a proteína para a membrana plasmática, permitindo o recrutamento e a ativação de emigrantes a jusante. MutantKRAS4b é um motorista oncogênico no câncer pancreático, colorretal e pulmonar10,e, como tal, a intervenção terapêutica teria um enorme benefício clínico. A produção de proteína recombinante autenticamente modificada que é farnesilado e carboximetilado permitiria triagem bioquímica usando KRAS4b em combinação com substitutos de membrana, como lipossomas ou nanodiscos lipídicos11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalisa a adição de pirofosfato farnério ao cisteína c-terminal no motivo CAAX em KRAS4b. Após a pré-nimação, a proteína é traficada para o retículo endoplasmático (ER), onde a enzima de conversão ras (RCE1) divide os três resíduos do terminal C. O passo final no processamento é a metilação do novo resíduo de farnesylcisteína c-terminal pela proteína da membrana er, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). A expressão de KRAS4b recombinante em E. coli resulta na produção de uma proteína não modificada. Tentativas anteriores de produzir KRAS4b processados foram limitadas devido a rendimentos insuficientes para experimentos estruturais ou de rastreamento de drogas ou não conseguiram recapitular a proteína madura nativa de corpo inteiro13,14. O protocolo apresentado aqui utiliza um sistema de expressão de células de insetos à base de baculovírus projetado e método de purificação que gera KRAS4b altamente purificado e totalmente processado a rendimentos de 5 mg/L da cultura celular.
A caracterização cuidadosa da proteína é essencial validar a qualidade das proteínas recombinantes antes de embarcar em biologia estrutural ou estudos de triagem de medicamentos. Dois parâmetros-chave do KRAS4b totalmente processado são a validação da modificação prenimita correta e a disponibilidade do C-terminus (FMe) farnesylatelado e carboximetilado para interação com substitutos de membrana ou lipídios. A espectrometria de massa de ionização de eletrospray (ESI-MS) do KRAS4b-FMe foi usada para medir o peso molecular e confirmar a presença das modificações de farnése e carboximetil. A espectrometria de massa nativa, onde as amostras são pulverizadas com solventes não desativação, foi usada para demonstrar que kras4b-fme também estava vinculado ao seu cofator do PIB. Finalmente, a espectroscopia de ressonância plasmon superficial foi usada para medir a ligação direta do KRAS4b-FMe com lipossomas imobilizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conforme observado na seção resultados representativos, o passo mais crítico durante a purificação é o manuseio da amostra durante o tempo em que está em sal inferior. Limitar o tempo em que a amostra é exposta a menos de 200 mM NaCl ajudará a reduzir a precipitação e aumentar o rendimento da amostra. A interpretação dos resultados do CEX pode ser difícil se o perfil não corresponder às expectativas (ver Figura 2). Até que o protocolo se torne rotina, é aconselhável que as…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o apoio à clonagem e expressão de Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew no Laboratório de Expressão de Proteínas, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Este projeto foi financiado no todo ou em parte com fundos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, o Contrato Nº. HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam endosso do Governo dos EUA
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Riferimenti
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