लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके ड्रोसोफिला भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स की प्रतिगामी ट्रेसिंग
Summary
हम लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके ड्रोसोफिला भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन्स के प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
हम ड्रोसोफिलामें मोटर न्यूरॉन्स की प्रतिगामी लेबलिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं । हम एक तेल से भंग लिपोफिलिक रंग का उपयोग करते हैं और माइक्रोइंजेक्टर द्वारा भ्रूण पट्टिका तैयार करने के लिए एक छोटी बूंद वितरित करते हैं। प्रत्येक मोटर न्यूरॉन जिसकी झिल्ली बूंद से संपर्क किया जाता है तो तेजी से लेबल किया जा सकता है। व्यक्तिगत मोटर न्यूरॉन्स लगातार लेबल कर रहे हैं, ठीक संरचनात्मक विवरण को सक्षम करने के लिए स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है । यह देखते हुए कि लिपोफिलिक रंग विभिन्न रंगों में आते हैं, तकनीक भी मल्टीकलर में लेबल आसन्न न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए एक साधन प्रदान करता है। इसलिए यह ट्रेसिंग तकनीक ड्रोसोफिलाके मोटर न्यूरॉन सिस्टम में न्यूरोनल मॉर्फोजेनेसिस और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।
Introduction
ड्रोसोफिला की भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन प्रणाली केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)1,2,3के विकास में अंतर्निहित तंत्र का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करती है। मोटर न्यूरॉन सिस्टम जैव रासायनिक, आनुवंशिक, इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों के लिए उत्तरदायी है। तकनीकों का उपयोग करके, आनुवंशिक जोड़तोड़ और कार्यात्मक विश्लेषण एकल मोटर न्यूरॉन्स2,4,5,6के स्तर पर किए जा सकते हैं।
तंत्रिका तंत्र के प्रारंभिक विकास के दौरान, न्यूरोब्लास्ट बड़ी संख्या में ग्लिया और न्यूरॉन्स को विभाजित और उत्पन्न करते हैं। डेलामिनेशन और न्यूरोब्लास्ट के जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल के बीच स्थानिक संबंध ों की पहले7,8,9के विस्तार से जांच की गई है । मोटर न्यूरॉन सिस्टम के मामले में, भ्रूण न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) के गठन का एसीसी (पूर्वकाल कॉर्नर सेल), आरपी2 (कच्चा झींगा 2), और आरपी5 मोटर न्यूरॉन्स2,10का उपयोग करके बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। उदाहरण के लिए, जब आरपी5 मोटर न्यूरॉन एक नवजात सिनैप्टिक जंक्शन बनाता है, तो प्री-सिनैप्टिक और पोस्ट-सिनैप्टिक फिलोपोडिया11,12,13को आपस में मिला दिया जाता है। एनएमजे गठन शुरू करने के लिए इस तरह का प्रत्यक्ष सेलुलर संचार महत्वपूर्ण है। परिधीय तंत्रिका शाखाओं के बारे में हम जो जानते हैं, उसके विपरीत, सीएनएस के भीतर सिनैप्टिक कनेक्टिविटी कैसे मोटर डैंडरियों शुरू करते हैं, इसका हमारा ज्ञान अभी भी आदिम है।
इस रिपोर्ट में, हम एक तकनीक पेश करते हैं जो लिपोफिलिक रंगों की माइक्रोपिपेट-मध्यस्थता वितरण के माध्यम से भ्रूण में मोटर न्यूरॉन्स की प्रतिगामी लेबलिंग की अनुमति देती है। यह तकनीक हमें अंडे बिछाने (एईएल)14के बाद 15 घंटे में हेमी-सेगमेंट में 30 शरीर की दीवार की मांसपेशियों में से प्रत्येक को 38 मोटर न्यूरॉन्स का पता लगाने में सक्षम बनाती है। इस तकनीक का उपयोग करके, हमारे समूह ने कई लाभ-समारोह/हानि-समारोह एलील्स15,16,17की अच्छी तरह से जांच की है । हमने हाल ही में आणविक तंत्रों को सुलझाया है जो मोटर डेंडराइट कनेक्टिविटी की शुरुआत करते हैं और यह प्रदशत करते हैं कि एक Dscam1-डॉक-पाक बातचीत एसीसी मोटर न्यूरॉन17में डेंराइट आउटग्रोथ की साइट को परिभाषित करती है। सामान्य तौर पर, यह तकनीक जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती उपभेदों में किसी भी भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय है, जो ड्रोसोफिला तंत्रिका तंत्र के कार्यात्मक डिजाइन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की हमारी क्षमता को बढ़ाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूरोनल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए रंग लेबलिंग के उपयोग आनुवंशिक सेल लेबलिंग तकनीकों पर कई फायदे हैं । डाया लेबलिंग तकनीक मोटर न्यूरॉन्स की मॉर्फोलोजी को लेबल करने और इमेजिंग करने के लिए आव?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए कामियामा लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनआईएच आर01 NS107558 (I.I., K.B., और डी.के.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
Riferimenti
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