Retrograd spårning av Drosophila embryonala motoriska nervceller med lipofila fluorescerande färgämnen
Summary
Vi beskriver en metod för retrograd spårning av Drosophila embryonala motoriska nervceller med lipofila fluorescerande färgämnen.
Abstract
Vi beskriver en teknik för retrograd märkning av motoriska nervceller i Drosophila. Vi använder en oljeupplöst lipofila färgämne och leverera en liten droppe till en embryonal filé beredning av en mikroinjektor. Varje motor neuron vars membran kontaktas av DROPP kan sedan snabbt märkas. Enskilda motoriska neuroner är kontinuerligt märkta, vilket gör att fina strukturella Detaljer tydligt visualiseras. Med tanke på att lipofila färgämnen finns i olika färger, tekniken ger också ett sätt att få intilliggande nervceller märkta i Multicolor. Denna spårningsteknik är därför användbar för att studera neuronala morfogenes och synaptisk konnektivitet i motorneuron system av Drosophila.
Introduction
Det embryonala motor neuron systemet i Drosophila erbjuder en kraftfull experimentell modell för att analysera mekanismerna bakom utvecklingen av centralanervsystemet (CNS)1,2,3. Den motoriska neuron systemet är mottaglig för biokemiska, genetiska, avbildning, och elektrofysiologiska tekniker. Med hjälp av teknikerna kan genetiska manipulationer och funktionella analyser utföras på samma nivå som enskilda motoriska neuroner2,4,5,6.
Under tidig utveckling av nervsystemet, neuroblaster dela och generera ett stort antal glia och neuroner. Den spatiotemporal relationen mellan delaminering och gen uttrycks profilen för neuroblaster har tidigare undersökts i detalj7,8,9. När det gäller motor neuron systemet, bildandet av embryonal neuromuskulär korsning (NMJ) har studerats utförligt med hjälp av aCC (främre hörncell), RP2 (rå räka 2), och RP5 motoriska nervceller2,10. Till exempel, när RP5 motor neuron bildar en begynnande synaptisk korsning, den pre Synaptic och efter Synaptic filopodia blandas11,12,13. Sådan direkt cellulär kommunikation är avgörande för att initiera NMJ bildandet. I motsats till vad vi vet om perifera nerv grenar, vår kunskap om hur motor dendriter initiera synaptisk anslutning inom CNS är fortfarande primitiv.
I denna rapport presenterar vi en teknik som möjliggör retrograd märkning av motoriska nervceller i embryon med hjälp av micropipett-medierad leverans av lipofila färgämnen. Denna teknik gör det möjligt för oss att spåra 38 motoriska nervceller innervating var och en av de 30 kroppen väggen muskler i en Hemi-segmentet på 15 h efter äggläggning (AEL)14. Genom att använda denna teknik, vår grupp har grundligt undersökt många vinst-of-funktion/förlust-av-funktion alleler15,16,17. Vi har nyligen avslöjad de molekylära mekanismer som driver initiering av motor Dendrit anslutning och visade att en Dscam1-dock-Pak interaktion definierar platsen för Dendrit utväxt i aCC motor neuron17. I allmänhet, denna teknik är anpassningsbar för fenotypisk analys av alla embryonala motoriska nervceller i vilda typ eller mutant stammar, förbättra vår förmåga att ge nya insikter i funktionell design av Drosophila nervsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av färgmärkning för att studera neuronala morfologi har flera fördelar jämfört med genetisk cell-märkning tekniker. Färgämnes märkning teknik kan minimera den tid som behövs för märkning och avbildning av morfologier av motoriska nervceller. Färgämnes märkning processen är ganska snabb eftersom det tar mindre än 2 h och gör det möjligt för oss att definiera konturerna av neuronala projektioner. Som ett alternativ kan man visualisera aCC motor neuron genom att välja en GAL4 linje som ut…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Kamiyama Lab för kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av en NIH R01 NS107558 (till M.I., K.B. och D.K.).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
Riferimenti
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Biologia dello sviluppo. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
