Summary
Förekomsten av diabetes och fetma ökar kontinuerligt över hela världen. Mekanismerna mellan diabetes, fetma och deras tillhörande dödlighet och komorbiditeter måste undersökas ytterligare. Här presenterar vi ett protokoll för sleeve gastrectomy (SG) i djur som en okomplicerad preklinisk modell av bariatric kirurgi.
Abstract
Antalet personer som är överviktiga och feta ökar kontinuerligt både i vuxen- och ungdomar. Detta sammanfaller med det ökade universella fenomenet typ 2-diabetes (T2D) och andra metaboliska problem. Bariatric kirurgi, såsom SG, är för närvarande en av de mest effektiva och vanligen används långtidsbehandling för fetma och T2D, men sambandet mellan dem är inte helt utforskas ännu. De mekanismer som ligger till grund för de resultat som setts efter bariatric kirurgi hos människor kan undersökas baserat på prekliniska djurstudier. SG minskar kroppsvikt, glukosnivåer och många metaboliska parametrar, och är lätt att utföra med en låg förekomst av komplikationer. Målet med detta arbete är att ge en enkel metod och en okomplicerad preklinisk modell av bariatric kirurgi hos djur för forskare.
Introduction
Förekomsten av fetma har ökat nästan trefaldigt i hela världen sedan 1975. År 2016 var över 1,9 miljarder vuxna äldre än 18 år överviktiga och över 650 miljoner vuxna var feta. Prevalensen av T2D i den vuxna befolkningen har också fördubblats från 4,7% till 8,5% med antalet ökar från 108 miljoner till 422 miljoner vuxna mellan 1980 och 2014 globalt1. De flesta bariatric operationer resultera i betydande viktminskning, en minskning av kroppsfett, och förbättring av glukostolerans, insulinresistens och diabetes kontroll2. Förutom viktminskning och eftergift av T2D, bariatric kirurgi ytterligare ger ytterligare hälsofördelar såsom hypertoni kontroll och en lägre förekomst av vissa typer av fetma relaterade cancer utveckling och progression3. Bariatric kirurgi inducerar också varaktig komplett, partiell eftergift av T2D, och minskar risken för tio år större kranskärlssjukdom (CHD) och en viss grad av cerebrovaskulär risk. De underliggande mekanismerna är dock inte helt förstådda4.
Det finns flera förfaranden för bariatric/metabolisk kirurgi. Både restriktiva och gastrointestinala bypass-operationer ger positiva effekter på metabolism5. Av de bariatric kirurgiska modellerna, SG och modifierade Roux-en-Y gastric bypass har högre framgång och lägre dödlighet och visa tillförlitlig restriktiv och gastrointestinal bypass kirurgi modeller i möss6. Även om den gastrointestinala bypass-operationen ger mer viktminskning och en signifikant förbättring av glukostolerans och leversteratos än det restriktiva förfarandet på lång sikt, producerar SG fortfarande god kontroll av kroppsvikt och glukosnivåer och är lätt att utföra med en låg förekomst av komplikationer6. Andelen SG ökade från 30% till 54% och Roux-en-Y gastric bypass kirurgi minskade från 52% till 32% från 2008 till 20147. För närvarande är laparoskopisk SG den vanligaste utförs bariatric förfarande på nationell nivå inom akademiska centra i USA8. Även om det har förekommit många publicerade rapporter om de patofysiologiska processerna mellan bariatric kirurgi, diabetes och fetma, behöver vi fler djurförsök för att ytterligare utforska okända mekanismer.
Detta protokoll syftar till att producera en djurisk metod för att undersöka de mekanismer som ligger till grund för de resultat som ses efter bariatric kirurgi hos människor. Den aktuella translationella studien kan ge insikter om mekanismen för fetma och T2D-behandling från SG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden för djurbruk godkändes av National Yang-Ming University Institutional Animal Care and Use Committee och följde "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8:e upplagan, 2011". Bedövningsproceduren utfördes enligt riktlinjen för smärtkontroll, anestesi, preoperativ och postoperativ vård för försöksdjuren från National Yang Ming University, ICAUC-016, 2015, 1st edition.
1. Beredning av djur
- Erhåll 20 8 veckor gamla vildtyp C57BL/6 hanmöss från National Laboratory Animal Center (NLAC) som väger runt 16-18 gram. Slumpmässigt tilldela dessa möss i SG eller bluff operation grupp med 10 möss vardera.
- Starta mössen på chow eller en fettrik kost (se Supplemental File) före bariatric eller skenoperationer9. Producera kost-inducerad fetma med minst 2 preoperative veckor av HFD.
- Hus mössen i National Yang-Ming University Laboratory Animal Center under en ljus-mörk cykel av 12:12 med ljus debut på 07:00 A.M. och tillåta fri utfodring till standard gnagare chow och vatten.
- Begränsa alla djur från mat men tillåta fri tillgång till vatten på natten före operationen.
2. Allmän preoperativ förberedelse
- Snabba mössen i minst 6 timmar före operationen. Framkalla anestesi i en induktionskammare med 5% isofluran och syre (båda 3-4 L/min).
- Kontrollera djupet av anestesi se till att nypa stimulering (trubbig böjda smidig mikro-tåtor) av baktassen, fram- och exempel, och örat inte framkalla någon motor reflex. Administrera antibiotika (25 mg/kg cefazolin) via subkutana injektioner före operationen.
- Tilldela en viss arbetszon för kirurgiska ingrepp. Rengör operationsområdet och spraya operationsbordet med 75% alkohollösning före en operation.
- Placera musen i noskonen och underhåll anestesi med 2% isofluran (2 L/min) och syre (4 L/min).
- För sleeve gastrectomy och skendrift, efter att ha bekräftat lämpligt djup anestesi genom tå stimulering, tillämpa 0,2% Carbomer öga gel på musens ögon för att förhindra torra ögon.
- Använd en elektrisk rakhyvel för att raka hår från buken till bröstbenet. Ta bort och rengör det återstående håret med en depilatory kräm. Placera och fixa musen på operationsbordet i ryggläge.
- Desinficera musens bukvägg med povidone-jodlösningar som alternerar med 75% alkohol för 3 applikationer.
3. Sleeve gastrektomi och skenförfaranden
- Median-laparotomi
- Använd en mikro-sax för att göra en 1-1,5 cm längd mittlinjen snitt vid övre delen av buken.
- Mage och tarm externalisering
- Utför SG-proceduren med hjälp av ett förstoringsskyldande dissekerande mikroskop eller förstoringsglas som nödvändigt för att förhindra den oförutsägbara blödningen och hypovolemisk chock.
- Använd två böjda släta sågtandade mikro-tång för att försiktigt flytta magen och slutföra externalisera den.
- Dela försiktigt upp det gastrosplenic ligament som förbinder den vänstra magen till mjälten med hjälp av en bomullsspetsad sond och elektrocauteri efter behov, och dissekera därmed magsäcken från den omgivande mjälten och andra inre organ.
4. Magisolering och klipp
OBS: SG för möss utfördes med hjälp av den nya clip applier tekniken som tidigare publicerats10.
- Sträck fundus och pylorus i magen försiktigt och lateralt med tänjningar, identifiera mittlinjen (Figur 1 och figur 2), och noggrant tillämpa kirurgiska klipp till hälften av den mediala sidan av magen mittlinjen från gastroesofageal korsningen inferiorly och den nedre polen superiorly. Kläm fast och uteslut runt 75-80% av magen och därigenom skapa hela magsäckens laterala hylsa (Figur 1 och figur 2).
- Flytta tarmen till den nakna huden på sidan och täck den med en varm-saltlösning fuktad gasväv och utföra intraperitoneal hydrering efter behov för att förhindra uttorkning och hypotermi.
- Resect den laterala klippt mage, ta bort den uteslutna hylsan i magen med mikroscissorer och sterilisera sedan den skurna kanten av magen med povidone-jodlösning.
- Överspända klipplinjen med en 5-0 monofilament icke-sorberbar sutur för att säkerställa inget läckage. Knut ändarna av suturen och förankra till klippen på endera änden.
- Återgå magen och tarmen till rätt läge i bukhålan och stäng buken med en löpande 5-0 monofilament nonabsorbable kontinuerlig och diskontinuerlig sutur till fascia och bukväggen.
- Administrera smärtstillande medel med ketoprofen (2-5 mg/kg) och antibiotika med cefazolin (25 mg/kg) intraperitoneally efter hela förfarandet.
5. Skenförfarande av SG
- Utför en liknande procedur som beskrivits tidigare med en mittlinje laparotomy, och externalisera tarmen och magen med hjälp av 37 °C våt varm saltlösning gasväv täckning för 5 min.
- Återgå magen och tarmen till de rätta platserna för dessa inre organ.
- Stäng bukväggen noggrant som tidigare beskrivits med 2 lager av kontinuerlig och diskontinuerlig förslutning till fascia och huden med hjälp av långsam eller icke-absorberbara monofilament suturer. Administrera smärtstillande medel med ketoprofen (2-5 mg/kg) och antibiotika med cefazolin (25 mg/kg) intraperitoneally efter hela förfarandet.
6. Allmän postoperativ vård
- Stoppa isofluran och fortsätt med ett rumsluftflöde på 3-5 L/min tills musen är helt vaken.
- Fortsätt att titta på musen medan den återfår rörligheten och börjar gå runt buren.
- Placera musen i en 30 °C oberoende inkubator i 5 dagar. Se till att det bara finns en mus per bur för att förhindra att mössen skadar varandra.
- Returnera fri tillgång till en gel diet mat (fettrik gel diet: 10% ister, 10% flytande socker, 57% vatten) i 3 dagar efter operationen och återinföra den tidigare tilldelade kosten 3 dagar efter operationen.
- Subkutant eller intraperitoneally injicera ketoprofen (2-5 mg/kg), och cefazolin (25 mg/kg) för 1 dag efter operationen.
- Bedöma musen kroppsvikt varje vecka genom hela studieperioden. Ge ketoprofen (2-5 mg/kg) genom intraperitoneal injektion för smärtkontroll en gång dagligen efter behov om djuret är i nöd efter operationen.
OBS: Här var överlevnadsgraden för SG 90% efter inlärningsperioden.
7. Bedömning av metabolisk parameter
- Snabba möss i 6 h, och ta blodprover på baslinjen (0 min). Få alla blodprover från spetsen på svansvenen av fritt rörliga möss11,12.
- Leverera 1 mg/g 50% dextros genom intraperitoneal injektion för glukostoleranstestet.
- Mät blodglukosen från spetsarna på svansvenerna hos fritt rörliga möss vid 0, 5, 15, 30, 60 och 120 min efter glukostillförsel på dubbla prover med glukometer och testremsor.
- Förvara hela blodprovet (n = 10 för varje grupp) vid rumstemperatur med koagulering i 30 minuter.
- Centrifugera blodprovet vid 3 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Överför plasman i separata rör utan störande blodproppar och förvara vid -80 °C.
- Studera plasmaproverna i slutet av studien med hjälp av kommersiella möss ELISA-satser för hemoglobin A1c (HBA1c), glukos, kolesterol och insulinnivåer enligt tillverkarens riktlinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat av operationen visas i figur 3 och figur 4. Överlevnadsgraden för studien var 90%. En mus dog i skengruppen på grund av svaghet och en annan mus dog i SG-gruppen den tredje dagen efter operationen av okänd anledning. Resultat som erhölls på viktminskning (Figur 3A) efter operation (vid vecka 3) på HFD-utfodrats möss var ganska lika de som observerats hos människa, med en slutlig kroppsvikt förlust på ca 15-20%13. Studien visade också att kolesterolnivån (Figur 3B) minskade betydligt efter SG-kirurgi i de HFD-utfodrat möss.
Bättre insulinkänslighet och glukostolerans observerades snart efter operationen genom ett intraperitoneal glukostolerans test (IPGTT). I den aktuella studien visade vi att den HFD-inducerade fetma framkallat insulinresistens och glukos intolerans hos vilda typ C57BL/6 möss och kan korrigeras med SG. Efter SG, insulinresistens, glukos, och lipidnivåer alla förbättrats i denna studie.
Bild 1: Kirurgiska ingrepp av SG.
(A) Det 5 mm kirurgiska klipp som används i denna experimentella modell. (B) Kontrollera anestesindjupet med nypstimulering. (C,D) Applicera klippet på hälften av mediala sidan av magen mittlinjen från gastroesofageal korsning inferiorly och nedre polen superiorly. (E) Sterilisera och suturera den skurna kanten av magen för att säkerställa inget läckage. (F-H) Hydrera mössen med varm saltlösning, returnera magen och tarmen tillbaka till rätt plats i bukhålan. Stäng bukhålan försiktigt. Återhämta sig från anesthetizing status i induktionskammaren och återgå till buren när villkoret var helt återhämtat sig och stabiliseras. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Platser för kirurgisk klippanvändning till magen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Effekten av SG på (A) kroppsvikten per vecka och (B) kolesterolnivå.
Data representeras som medelvärde ± SD. *P < 0,05; **P < 0.001. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Effekt av SG på (A) IPGTT (B) Hba1c och (C) HOMA-IR i slutet av studien.
(n = 5 VSG; n = 7 sham); Data representeras som medelvärde ± SD. *P < 0,05; **P < 0.001. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De flesta av de prospektiva kohortstudierna har bekräftat att en ökning av body mass index är relaterat till att öka dödligheten. Fetma är förknippad med en högre risk för diabetes, hjärt-kärlsjukdomar (CVD), och död hos båda könen. De specifika patologiskt processer har etablerat ett samband mellan diabetes, fetma, och dödlighet14. De systematiska recensionerna anger fördelarna med bariatric kirurgi i att minska riskfaktorer för CVD med bevis för ventrikulär hypertrofi regression och förbättrad diastolisk funktion samt15. Bariatric/ metabolisk kirurgi kan förbättra traditionella CVD riskfaktorer hos överviktiga diabetiker patienter, och den 10-åriga CHD och dödlig CHD risk har visat sig vara nedsatt med upp till 50% efter olika bariatric / metaboliska kirurgiska ingrepp hos överviktiga patienter med T2D4.
Bariatric kirurgi är den mest effektiva långsiktiga terapeutiska strategin för fetma. De signifikanta förbättringarna av metaboliska parametrar från bariatric kirurgi såsom lipidprofil, inflammatoriska biomarkörer, blodtryck, och hjärtsvikt noteras också särskilt i den oväntade typ 2 diabetiker kontroll. SG har minskat och modifierat fettvävnadsinflammation och utveckling och har möjligen minskat aterosklerosrisken.
Förändringar av mag-tarmhormoner kan spela en roll i långsiktig viktkontroll16,17. SG har också minskat kaloriintaget och normaliserat den glykemiska kontrollen18. Den gastric bypass kirurgi relaterade glykemiska tolerans effekter är relaterade till foregut hormonella effekter framkallas genom att kringgå proximala tarm från de nuvarandeteorierna 19. SG har dock visat den jämförbara antidiabetiska effekten, vilket tyder på ytterligare icke-förbikoppling relaterade okända mekanismer även utöver effekten av glukagon-liknande peptid 1 receptor16,20. Lopez et al. har visat att SG främjar viktminskning, förbättrar kolesterol och glukos profil, leptin okänslighet, och minskar insulinresistens, som är oberoende av ghrelin nivå förändringar i feta Zucker råttor21. Alla dessa ovan nämnda frågor behöver ytterligare djurstudier för att klargöra sambandet med diabetes, fetma och sjukdomar. SG är en bariatric förfarande som inte innebär intestinala bypass, som har blivit allt populärare under de senaste decennierna i USA och globalt på grund av låg långsiktiga komplikationer22.
Den bariatric kirurgiska ingreppet är tekniskt svårt och tidskrävande med hög kirurgisk dödlighet och långsiktiga komplikation och är det viktigaste kritiska steget för små djurförsök. SG är för närvarande den mest använda kirurgi för viktminskning i USA eftersom det är ett enkelt förfarande med hög effektivitet, låg komorbiditet, och låg dödlighet. Detta protokoll har liknande fördelar härma viktminskning och metaboliska operationer praktiseras rutinmässigt hos människor. I allmänhet är kirurgiska tekniker ganska svåra hos möss på grund av den lilla kroppsstorleken, och ett dissekerande mikroskop behövs ofta med hög kirurgisk dödlighet.
Schlager et al. har utvecklat en musmodell av SG med en kirurgisk klippapplikation istället för en handsydd stängning för magen. Denna djurmodell har visat liknande effekter av kroppens vikt minskning och glukoskontroll, men har misslyckats med att avslöja betydande bukspottskörteln holme cell spridning10. Denna effekt på metabolismen från denna möss modell liknar den mänskliga bariatric / metabolisk kirurgi med en mycket låg operativ dödlighet.
Denna aktuella studie visar konstant viktreduktion efter SG i HFD matas möss med förbättrad glykated hemoglobin, IPGTT, HOMA-IR (homeostatisk modell bedömning för insulinresistens), och kolesterol nivå. Detta kirurgiska ingrepp är säkert och lätt att utföra i möss.
Den kirurgiska överlevnaden av detta protokoll i vårt laboratorium är cirka 90% efter en inlärningsperiod, och förfarandet tar mindre än 15 minuter. Detta protokoll kan ge betydande värde i framtida små gnagare studier med kirurgisk genomförbarhet, säkerhet, reproducerbarhet, och klinisk relevans. Denna metod kan också användas för att belysa fysiologiska förändringar som observerats efter bariatric kirurgi hos människor. Svårigheten med SG kirurgi spelar en viktig faktor i framgången för djurstudier. Detta protokoll är lätt att utföra, och imiterar SG som vanligen praktiseras i andra djur- och humanstudier.
Denna djurmodell kan undersöka den kliniska relevansen av diabetes och fetma med hjälp av ett kort kirurgiskt ingrepp med sleeve gastrectomy. Dessa förfaranden kan förkorta operationstiden och förbättra den kirurgiska överlevnadsgraden. Den största fördelen med denna studie är att efterlikna de kliniska resultaten av bariatric kirurgi i mänskliga patienter med hjälp av en enkel kirurgisk modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar miss Isabelle Lu för det engelska berättandet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% normal saline | China Chemical & Pharmaceutical Co., Ltd. | ||
| 5-0 monofilament suture | Shineteh Inc. Taiwan | Ethicon | |
| Alm | Shineteh Inc. Taiwan | ST-A072PK | UNIK |
| Animal Anesthesia | Step Technology | 0712VAP11076 | Matrx |
| Barraqer-Troutman forceps | Shineteh Inc. Taiwan | ST-N309(H-4410) | UNIK |
| cefazolin | Taiwan veteran pharmacy company | ||
| Chow diet | Research Diets | ||
| Glucose strips and glucometer | BeneCheck | BKM13-1 | BeneCheck |
| HbA1c kit | Level | OKEH00661 | |
| Hematology system | Fuji | FUJI DRI-CHEM 4000i | Europe |
| High Fat diet | Research Diets | 1810724 | LabDiet |
| Iris Forceps | Shineteh Inc. Taiwan | ST-1210 | UNIK |
| Iris Scissors | Shineteh Inc. Taiwan | ST-S011 | UNIK |
| Isoflurane | Panion & BF biotech INC | 8547 | Panion & BF |
| Ketoprofen | Sigma | 22071154 | Sigma-Aldrich |
| Stereo microscope | MicroTech | SZ-5T | MicroTech |
| Surgical clip (M) | Echicon Inc., Somerville, NJ | Size M, 5mm | |
| Vidisic gel | Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH |
References
- WHO.
- Buchwald, H., et al. Bariatric surgery: a systematic review and meta-analysis. Journal of the American Medical Association. 292 (14), 1724-1737 (2004).
- Schauer, D. P., et al. Bariatric Surgery and the Risk of Cancer in a Large Multisite Cohort. Annals of Surgery. 269 (1), 95-101 (2019).
- Wei, J. H., et al. Metabolic surgery ameliorates cardiovascular risk in obese diabetic patients: Influence of different surgical procedures. Surgery for Obesity and Related Diseases. 14 (12), 1832-1840 (2018).
- Lee, W. J., Aung, L. Metabolic Surgery for Type 2 Diabetes Mellitus: Experience from Asia. Diabetes & Metabolism. 40 (6), 433-443 (2016).
- Yin, D. P., et al. Assessment of different bariatric surgeries in the treatment of obesity and insulin resistance in mice. Annals of Surgery. 254 (1), 73-82 (2011).
- Abraham, A., et al. Trends in Bariatric Surgery: Procedure Selection, Revisional Surgeries, and Readmissions. Obesity Surgery. 26 (7), 1371-1377 (2016).
- Varela, J. E., Nguyen, N. T. Laparoscopic sleeve gastrectomy leads the U.S. utilization of bariatric surgery at academic medical centers. Surgery for Obesity and Related Diseases. 11 (5), 987-990 (2015).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Schlager, A., et al. A mouse model for sleeve gastrectomy: applications for diabetes research. Microsurgery. 31 (1), 66-71 (2011).
- Pressler, J. W., et al. Vertical sleeve gastrectomy restores glucose homeostasis in apolipoprotein A-IV KO mice. Diabetes. 64 (2), 498-507 (2015).
- Williams, L. M., et al. The development of diet-induced obesity and glucose intolerance in C57BL/6 mice on a high-fat diet consists of distinct phases. PLoS One. 9 (8), 106159 (2014).
- Huang, R., Ding, X., Fu, H., Cai, Q. Potential mechanisms of sleeve gastrectomy for reducing weight and improving metabolism in patients with obesity. Surgery for Obesity and Related Diseases. 15 (10), 1861-1871 (2019).
- Bender, R., Zeeb, H., Schwarz, M., Jockel, K. H., Berger, M. Causes of death in obesity: relevant increase in cardiovascular but not in all-cancer mortality. Journal of Clinical Epidemiology. 59 (10), 1064-1071 (2006).
- Vest, A. R., Heneghan, H. M., Agarwal, S., Schauer, P. R., Young, J. B. Bariatric surgery and cardiovascular outcomes: a systematic review. Heart. 98 (24), 1763-1777 (2012).
- Ionut, V., Burch, M., Youdim, A., Bergman, R. N. Gastrointestinal hormones and bariatric surgery-induced weight loss. Obesity (Silver Spring). 21 (6), 1093-1103 (2013).
- Arble, D. M., Sandoval, D. A., Seeley, R. J. Mechanisms underlying weight loss and metabolic improvements in rodent models of bariatric surgery. Diabetologia. 58 (2), 211-220 (2015).
- Schneck, A. S., et al. Effects of sleeve gastrectomy in high fat diet-induced obese mice: respective role of reduced caloric intake, white adipose tissue inflammation and changes in adipose tissue and ectopic fat depots. Surgical Endoscopy. 28 (2), 592-602 (2014).
- Rubino, F., R'Bibo, S. L., del Genio, F., Mazumdar, M., McGraw, T. E. Metabolic surgery: the role of the gastrointestinal tract in diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 6 (2), 102-109 (2010).
- Wilson-Perez, H. E., et al. Vertical sleeve gastrectomy is effective in two genetic mouse models of glucagon-like Peptide 1 receptor deficiency. Diabetes. 62 (7), 2380-2385 (2013).
- Lopez, P. P., Nicholson, S. E., Burkhardt, G. E., Johnson, R. A., Johnson, F. K. Development of a sleeve gastrectomy weight loss model in obese Zucker rats. Journal of Surgical Research. 157 (2), 243-250 (2009).
- Koch, T. R., Shope, T. R. Laparoscopic Vertical Sleeve Gastrectomy as a Treatment Option for Adults with Diabetes Mellitus. Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2020).
