Vi presenterar ett tvådelat protokoll som kombinerar fluorescerande kalciumavbildning med in situ hybridisering, vilket gör att experimentören att korrelera mönster av kalciumaktivitet med genuttryckprofiler på en cellnivå.
Spontan intracellulär kalciumaktivitet kan observeras i en mängd olika celltyper och föreslås spela kritiska roller i en mängd olika fysiologiska processer. I synnerhet är lämplig reglering av kalciumaktivitetsmönster under embryogenes nödvändigt för många aspekter av ryggradsdjurs neural utveckling, inklusive korrekt neural rörstängning, synaptogenes och signalsubstansfenotypspecifikation. Även om observationen att kalciumaktivitetsmönster kan skilja sig åt i både frekvens och amplitud tyder på en övertygande mekanism genom vilken dessa flöden kan överföra kodade signaler till nedströms effektorer och reglera genuttryck, befintliga metoder på befolkningsnivå har saknat den precision som krävs för att ytterligare undersöka denna möjlighet. Dessutom begränsar dessa metoder studier av cellcellsinteraktionernas roll genom att utesluta förmågan att analysera tillståndet för neuronal bestämning i avsaknad av cellcellkontakt. Därför har vi etablerat ett experimentellt arbetsflöde som partime-lapse kalcium avbildning av dissocierade neuronal explants med en fluorescens in situ hybridisering analys, vilket möjliggör entydig korrelation av kalcium aktivitet mönster med molekylär fenotyp på en cellnivå. Vi kunde framgångsrikt använda detta tillvägagångssätt för att skilja och karakterisera specifika kalciumaktivitetsmönster i samband med att skilja neurala celler och neurala stamceller, respektive; Utöver detta skulle dock den experimentella ram som beskrivs i denna artikel lätt kunna anpassas för att undersöka korrelationer mellan alla aktivitetsprofiler i tidsserier och uttryck för en gen eller gener av intresse.
Gratis cytosolic kalcium är avgörande för en mängd olika biologiska processer, allt från cellproliferation och migration till apoptos och autofagi1,2,3. Inom dessa vägar kan kalcium utöva nedströmseffekter på genuttryck genom att interagera med kalciumbindande domäner för att inducera konformationella förändringar som modulerar proteinaktivitet och interaktioner. Till exempel, en neuronal kalciumsensor som kallas Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) hålls i en ovikt mellanliggande konformation när den är bunden av kalcium, hindrar den från att interagera med sitt protein och DNA mål4. Utöver att fungera som en enkel signalering molekyl, men den dynamiska karaktären av intracellulära kalciumtransienter tillåter dessa aktivitetsmönster att koda mer komplexa amplitud- eller frekvensbaserade signaler5,6. Nukleär flyttning av transkriptionsfaktorn kärnfaktor av aktiverade T-celler (NFAT) förstärks av högfrekventa kalciumsvängningar men hämmas av lågfrekventa svängningar7. Övertygande, senaste arbetet har föreslagit att NFAT faktiskt kan vara lyhörd för kumulativ kalciumexponering8. Både calcineurin och Ca2 +/ calmodulin-beroende protein kinas II (CaMKII) uppvisar också tydliga svar på kalcium transienter av en viss frekvens, varaktighet, eller amplitud9. För att lägga till en ytterligare nivå av reglerande komplexitet, beräkningsmodeller tyder på att många nedströms kalcium-bindande proteiner blir mer eller mindre frekvensberoende som svar på förekomsten eller frånvaron av bindande konkurrenter10,11.
Inom det utvecklande nervsystemet har två huvudklasser av kalciumaktivitetsbeteenden definierats och associerats med specifika biologiska processer. Kalcium tillströmningar klassificeras som “spikar” om de förekommer inom enskilda celler, nå en toppintensitet på ~ 400% av baslinjen inom fem sekunder, och uppvisar dubbla exponentiellt förfall12. Denna typ av signal är främst associerad med signalsubstansen fenotyp specifikation13. Däremot definieras “vågor” som långsammare, mindre extrema kalciumtransienter där en cells intracellulära kalciumkoncentration stiger till ~200% av baslinjen under en period av trettio sekunder eller mer, sedan sönderfaller under flera minuter12. Dessa signaler sprider sig ofta över flera angränsande celler, och deras närvaro har associerats med neurite utväxt och cellspridning14,15. Även om dessa två klasser har definierats baserat på karakteristiska kinetiska profiler, är det fortfarande oklart exakt vilka egenskaper hos dessa mönster faktiskt upptäcks av celler och översätts av nedströms effektorer.
Att förstå förhållandet mellan intracellulära kalciumsvängningar och genuttryck skulle ge avgörande inblick i en av de regleringsmekanismer som säkerställer lämplig utveckling och mönster av nervsystemet. För detta ändamål, studier av embryonala ryggmärgen har visat att ökad kalciumspike aktivitet under utvecklingen är associerad med högre nivåer av hämmande nervceller, medan minskad kalciumspike aktivitet är associerad med högre nivåer av excitatoriska nervceller13. Emellertid, dessa befolkningsnivå analyser har inte använts för att associera kalciumaktivitet med genuttryck på en cellnivå.
Att närma sig dessa frågor på nivån för den enskilda cellen erbjuder flera olika fördelar jämfört med tidigare arbete. För en, förmågan att bedöma kalciumaktivitet och genuttryck i många celler individuellt gör att hela repertoaren av distinkta aktivitetsmönster som skall observeras utan att fördunkas av en bulk-nivå mätning. Dessutom innebär studier av dessa relationer i primärkulturen i en cell att cellautonoma kopplingar mellan kalciumaktivitet och genuttryck kommer att upprätthållas, medan interaktioner som kräver cellcellkommunikation kommer att upphävas. Därför gör detta tillvägagångssätt dessa cellautonoma mekanismer som kan studeras isolerat. Emellertid, Det gör också att rollen av icke-cell-autonoma kalciumaktivitet som skall klargöras och förhöras. Till exempel kan celler dissekeras från ett embryo i neurala plattan skede, odlade tills syskon kontroller når neuralrörsstadiet, och sedan jämfört med celler som nyligen har dissekerats från en neural-tube-steg embryo. Detta möjliggör direkt jämförelse av celler som behöll cellcellkommunikation under en viktig utvecklingsperiod till dem där cellcellkommunikation avskaffades.
I syfte att ta itu med begränsningarna i tidigare experimentella metoder, utvecklade vi ett protokoll som skulle möjliggöra bedömning av både kalciumaktivitet och genuttryck i enskilda neurala stamceller, underlätta sambandet mellan specifika aktivitetsmönster med efterföljande differentiering sprogram. Neural vävnad dissekerades från Xenopus laevis i olika stadier av neural utveckling, separeras i enstaka celler, och avbildades via konfokal mikroskopi i närvaro av en fluorescerande kalciumindikator. Efter levande cell avbildning, prover fastställdes och analyseras via fluorescens in situ hybridisering (FISH) för att upptäcka uttryck för en gen eller isoform av intresse. Viktigt, enskilda celler kan spåras över båda bildframställning experiment, vilket innebär att en cells kalcium aktivitet profil och dess genuttryck nivå kan associeras med varandra(figur 1). Protokollet rapporteras här är avsett att sond relationer mellan kalcium aktivitetsmönster och genuttryck över embryonal neuroutveckling i Xenopus laevis. Den bredare experimentella ramen (encellig tidskurssombehandling följt av FISH och bildkoregistrering) kan dock ändras och tillämpas på praktiskt taget alla celltyper, fluorescerande reporter och gen av intresse.
Karakteristiska mönster av kalciumaktivitet har observerats i de celler som utgör det utvecklande nervsystemet, med specifika typer av aktivitet i samband med distinkta neuroutvecklingsprocesser. Ytterligare förståelse av de mekanismer genom vilka dessa informationstäta aktivitetsmönster översätts till transkriptionella svar kräver dock att information om kalciumaktivitet och genuttryck samlas in med encellig upplösning. Medan system som uppvisar mer stereotyp kalcium aktivitet, såsom mogna nervceller, kan rimligen analyseras på en bulk nivå, de oregelbundna mönster som kännetecknar embryonala nervsystemet är lätt maskeras av mindre exakta inspelningar.
Den experimentella ram som fastställs i detta protokoll är lätt att anpassa sig till en mängd olika celltyper och fluorescerande reportrar. Vävnad som innehåller praktiskt taget alla celltyper eller kombinationer av celltyper kan dissekeras från en modellorganism av intresse och pläteras för encellig avbildning. Förutom att tillåta cellidentifiering och isolera effekten av cellautonoma processer, gör en primär cellkultur metod experimentören att definiera mediekomponenter som önskas. Till exempel, experiment jämföra aktiviteten hos neuronala prekursorer i 2 mM Ca2 + lösning har utförts för att undersöka om förhållandet mellan spike frekvens och signalsubstansfenotyp i embryonala ryggmärgen kan rekapituleras utan påverkan av cellceller interaktioner13,20.
Även om detta protokoll utnyttjar lysrörsmarkören Fluo4-AM för att upptäcka intracellulär kalciumaktivitet, beroende på urvalskriterierna, kan användare välja andra kommersiellt tillgängliga markörer21, inklusive genetiskt kodade kalciumindikatorer. På samma sätt kan alternativa markörer användas för att övervaka dynamiska förändringar i koncentrationen av en jon av intresse (inklusive K+, Na+och Zn2+), membranpotential eller cellulära pH. Bildinställningar och bildvaraktighet kan ändras vid behov.
Även om vi korrelerade kalciumaktivitet och neuronal fenotyp som en specifik applikation, är denna metod också tillämplig för en mängd andra cellulära egenskaper. Till exempel kan fluorescens i situ hybridisering utföras med sonder mot någon gen av intresse, inklusive neuronal markör ChAT eller transkriptionsfaktorn Engrailed, vilket möjliggör känslig upptäckt av en anpassningsbar panel av mRNA arter. Dessa sonder kan utformas för att vara isoformspecifika, stödja ytterligare målspecificitet om så önskas. Dubbel fisk kan utföras med hjälp av sonder konjugerade till flera två olika fluorofforer, vilket möjliggör samtidig bedömning av uttrycket av flera gener. De ytterligare tvättar som krävs av denna typ av experiment är dock förknippade med en ökad chans till cellförlust eller rörelse och kräver erfarenhet och delikatess som ska utföras framgångsrikt.
Oavsett eventuella experimentspecifika ändringar som gjorts i det här protokollet finns det flera viktiga steg som kräver noggrann uppmärksamhet. Dissektioner bör utföras med försiktighet för att avlägsna alla förorenande vävnader eller cellpopulationer. eftersom rumsliga mönster går förlorade när utväxter separeras, kommer eventuella återstående celler från angränsande vävnader att varvas med och omöjligatt skilja från de celler av intresse. När cellerna har pläterats ska proverna hanteras så försiktigt som möjligt för att förhindra att celler lossnar. Viktigast av allt innebär detta att alla lösningsändringar bör utföras långsamt och försiktigt, med pipetten placerad vid kanten av plattan när lösningen tas bort och tillsätts. Detta kommer att säkerställa att celler kan identifieras tryggt i både kalcium och FISK bilder. Om celler störs under bearbetningen kan det vara omöjligt att identifiera vissa eller alla motsvarande celler mellan de två bilderna. Vi rekommenderar felning på sidan av försiktighet med dessa uppdrag, så att endast entydigt motsvarande celler används för vidare analys.
Beroende på vilken biologisk fråga som tas upp kan en mängd olika analysmetoder vara lämpliga. Kalciumaktiviteten i tidsserier kan bearbetas och kvantifieras på olika sätt, med experimentflexibilitet när det gäller att välja avtrender parametrar, analysmått och analysparametrar (till exempel % av baslinjetröskeln som används för att definiera en kalciumspik). Korrelationer mellan kalciumaktivitet och genuttrycksnivå kan ritas genom att analysera genuttryck som ett absolut eller relativt fluorescensvärde som utvinns ur FISH-bilden. Alternativt kan korrelationer mellan kalciumaktivitet och genuttryck (närvaro/frånvaro) dras genom att definiera en fluorescenströskel för positiv genuttryckssignal och tilldela “ja” eller “nej”-identifierare till enskilda celler. Som helhet ger detta experimentella schema en otroligt flexibel pipeline för insamling och preliminär analys av tidsseriedata tillsammans med cellmatchade genuttrycksdata. Sådana experiment kommer att vara avgörande för att bättre förstå de komplexa relationerna mellan cellulär dynamik och transkriptionella förändringar, vilket exemplifieras av identifiering av kalciumaktivitetsmönster som är karakteristiska för hämmande-utskändade och excitatoriska-utskändade neuronal prekursorer i embryonala Xenopus laevis.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Wendy Herbst och Lindsay Schleifer för deras bidrag till utvecklingen av dessa protokoll. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 och 1R15HD096415-01) till MSS.
For Animal Husbandry & Cell Culture | |||
CHORULON (chorionic gonodotropin) | Merck Animal Health | ||
Gentamycin sulfate salt | Millipore Sigma | G1264 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm | Millipore Sigma | CLS3160102 | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm | Fisher Scientific | 08-772A | |
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Fisher Scientific | 12-565-90 | |
Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521 | |
Collagenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
Dumont #55 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Dumont #5 Forceps, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-00 | |
Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface | Nexcelom Bioscience | CLS5-25D-050 | |
For Calcium Imaging | |||
Fluo-4, AM, cell permeant | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Thermo Fisher Scientific | P6866 | |
For RNA Probe Generation | |||
PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
rATP | Promega | P1132 | |
rCTP | Promega | P1142 | |
rGTP | Promega | P1152 | |
rUTP | Promega | P1162 | |
Digoxigenin-11-UTP | Millipore Sigma | 3359247910 | |
Rnase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | N8080119 | |
T3 RNA Polymerase | Promega | P2083 | |
T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
RQ1 Rnase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
LiCl Precipitation Solution (7.5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
For Fluorescence In Situ Hybridization | |||
Acetic Anhydride | Thermo Fisher Scientific | 320102 | |
Blocking Reagent | Millipore Sigma | 11096176001 | |
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Millipore Sigma | 11207733910 | |
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester | Millipore Sigma | GEPA13105 | |
Solution Components | |||
Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs | Fisher Scientific | AC349610 | |
Calcium chloride dihydrate | Millipore Sigma | C3306 | |
CHAPS hydrate | Millipore Sigma | C3023 | |
Denhardt's Solution (50X) | Thermo Fisher Scientific | 750018 | |
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Millipore Sigma | E3889 | |
Formamide (Deionized) | Thermo Fisher Scientific | AM9342 | |
Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Millipore Sigma | H3393 | |
HEPES (Ultra Pure) | Thermo Fisher Scientific | 11344041 | |
Hydrogen peroxide solution | Millipore Sigma | H1109 | |
L-Cysteine | Millipore Sigma | 168149 | |
Magnesium chloride, pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC223211000 | |
Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous | Fisher Scientific | AC413480050 | |
Maleic Acid, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | ACS125231000 | |
MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP308 | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX | Millipore Sigma | R3629 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S7653 | |
Triethanolamine | Millipore Sigma | 90279 | |
Tris | Millipore Sigma | GE17-1321-01 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P9416 | |
Equipment | |||
Laminar Flow Hood | model of choice | ||
Dissecting Microscope | model of choice | ||
Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | TE200 | |
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Shaking Incubator | model of choice | ||
Refrigerated Centrifuge | model of choice | ||
Miscellaneous | |||
Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 μm pore, 500 mL bottle capacity | Millipore Sigma | CLS430769 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |