Berikelse av pattedyrvev og Xenopus oocytter med kolesterol

Summary

To metoder for kolesterol berikelse presenteres: anvendelsen av cyklodextrin mettet med kolesterol for å berike pattedyr vev og celler, og bruk av kolesterolberiket fosfolipid-baserte dispersjoner (liposomer) for å berike Xenopus oocytes. Disse metodene er instrumentelle for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer i molekylær, cellulær og organfunksjon.

Abstract

Kolesterol berikelse av pattedyr vev og celler, inkludert Xenopus oocytes som brukes til å studere cellefunksjon, kan oppnås ved hjelp av en rekke metoder. Her beskriver vi to viktige tilnærminger som brukes til dette formålet. Først beskriver vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av cyclodextrin mettet med kolesterol ved hjelp av cerebralarterier (vev) og hippocampal nevroner (celler) som eksempler. Denne tilnærmingen kan brukes til alle typer vev, celler eller cellelinjer. En alternativ tilnærming for kolesterol berikelse innebærer bruk av lav tetthet lipoprotein (LDL). Fordelen med denne tilnærmingen er at den bruker en del av det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen. Men mens cyclodextrin tilnærming kan brukes til å berike noen celletype interesse med kolesterol, er LDL-tilnærmingen begrenset til celler som uttrykker LDL-reseptorer (f.eks. leverceller, benmargsavledede celler som blodleukocytter og vevmakrofager), og nivået av berikelse avhenger av konsentrasjonen og mobiliteten til LDL-reseptoren. Videre inkluderer LDL-partikler andre lipider, så kolesterollevering er ikke spesifikk. For det andre beskriver vi hvordan du beriker Xenopus oocytes med kolesterol ved hjelp av en fosfolipidbasert dispersjon (dvs. liposomer) som inkluderer kolesterol. Xenopus oocytes utgjør et populært heterologøst uttrykksystem som brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. For både cyklodekstrin-basert kolesterolberikelse tilnærming av pattedyrvev (cerebral arterier) og for fosfolipid-basert kolesterol berikelse tilnærming av Xenopus oocytes, viser vi at kolesterol nivåer nå maksimalt etter 5 min inkubasjon. Dette nivået av kolesterol forblir konstant i lengre perioder med inkubasjon (f.eks. 60 min). Sammen gir disse dataene grunnlag for optimaliserte temporale forhold for kolesterolberikelse av vev, celler og Xenopus oocytter for funksjonelle studier som tar sikte på å avhøre virkningen av kolesterolberikelse.

Introduction

Kolesterol, en stor cellulær lipid, spiller mange kritiske funksjonelle og strukturelle roller^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}. Fra å regulere plasmamembranens fysiske egenskaper til å sikre cellelevedyktighet, vekst, spredning og fungerer som et signal- og forløpermolekyl i en mengde biokjemiske veier, er kolesterol en viktig komponent som er nødvendig for normal celle- og organfunksjon. Som et resultat resulterer kolesterolmangel i alvorlige fysiske misdannelser og en rekke lidelser. På den annen side er selv en liten økning i kolesterol over fysiologiske nivåer (2-3x) cytotoksisk^1,2,10 og har vært forbundet med utvikling av lidelser, inkludert^{kardiovaskulære 11,12,13} og nevrodegenerative sykdommer^14,15,16,17. Dermed, for å avhøre de kritiske funksjonene til kolesterol og for å bestemme effekten av endringer i kolesterolnivåer, er forskjellige tilnærminger som endrer innholdet av kolesterol i vev, celler og Xenopus oocytter utviklet.

Endring av kolesterolnivåer i pattedyrvev og celler
Flere tilnærminger kan utnyttes for å redusere nivåene av kolesterol i vev og celler¹⁸. En tilnærming innebærer deres eksponering for statiner oppløst i lipoprotein-mangelfull serum for å hemme HMG-CoA reduktase, som styrer frekvensen av kolesterolsyntese^19,20. Men, disse kolesterolsenkende legemidler også hemme dannelsen av ikke-sterol produkter langs mevalonatbanen. Derfor legges en liten mengde mevalonat for å tillate dannelsen av disse produktene²¹ og forbedre spesifisiteten til denne tilnærmingen. En annen tilnærming for å redusere kolesterolnivået innebærer bruk av β-cyclodextrins. Disse glucopyranose monomerene har et internt hydrofobt hulrom med en diameter som samsvarer med størrelsen på steroler²², noe som letter utvinning av kolesterol fra celler, og dermed tømme dem fra deres innfødte kolesterolinnhold²³. Et eksempel er 2-hydroksypropyl-β-cykloderxtrin (HPβCD), et preklinisk stoff som for tiden testes for behandling av Niemann-Pick type C-sykdommen, en genetisk arvelig dødelig metabolsk lidelse preget av lysosomal kolesterollagring²⁴. Nivået av kolesteroluttømming avhenger av det spesifikke derivatet som brukes. For eksempel, HPβCD trekker kolesterol med en lavere kapasitet enn metylert derivat, metyl-β-cyclodextrin (MβCD)^{24,25,26,27,28,29,30}. Spesielt kan imidlertid β-cyklodekkliner også trekke ut andre hydrofobe molekyler i tillegg til kolesterol, noe som deretter kan resultere i uspesifikke effekter³¹. I motsetning til uttømming kan celler og vev spesifikt berikes med kolesterol gjennom behandling med β-cykloderklatrin som har vært forutmettet med kolesterol²³. Denne tilnærmingen kan også brukes som en kontroll for spesifisiteten av β-cyclodextrins som brukes til kolesterol uttømming³¹. Uttømming av kolesterol fra vev og celler er grei og kan oppnås ved å utsette cellene i 30-60 min til 5 mM MβCD oppløst i mediet som brukes til lagring av cellene. Denne tilnærmingen kan resultere i en 50% reduksjon i kolesterolinnhold (f.eks. i hippocampale nevroner³², rotte cerebralarterier³³). På den annen side er det mer komplisert å forberede β-cyclodextrin-kolesterolkomplekset for kolesterolberikelse av vev og celler, og vil bli beskrevet i protokollseksjonen.

En alternativ tilnærming til berikende vev og celler ved hjelp av β-cyclodextrin mettet med kolesterol innebærer bruk av LDL, som er avhengig av LDL reseptorer uttrykt i vev / celler¹⁸. Mens denne tilnærmingen gir fordelen av å bruke det naturlige kolesterolhomeostase maskineriet i cellen, har den flere begrensninger. For det første kan ikke vev og celler som ikke uttrykker LDL-reseptoren berikes ved hjelp av denne tilnærmingen. For det andre inneholder LDL-partikler andre lipider i tillegg til kolesterol. Spesielt består LDL av proteinet ApoB₁₀₀ (25 %) og følgende lipider (75%): ~ 6-8% kolesterol, ~ 45-50% cholesteryl ester, ~ 18-24% fosfolipider, og ~ 4-8% triacylglycerols³⁴. Dermed er levering av kolesterol via LDL-partikler ikke-spesifikk. For det tredje kan prosentandelen av økning i kolesterolinnhold ved LDL i vev og celler som uttrykker LDL-reseptoren være betydelig lavere enn økningen observert ved hjelp av cyklodekstrin mettet med kolesterol. For eksempel, i en tidligere studie, berikelse av gnager cerebral arterier med kolesterol via LDL resulterte i bare en 10-15% økning i kolesterolnivåer³⁵. I motsetning resulterte berikelse av disse arteriene med cyclodextrin mettet med kolesterol som beskrevet i protokollseksjonen,& gt; 50% økning i kolesterolinnholdet (se Representative Results seksjon, figur 1).

Endring av kolesterolnivåer i Xenopus oocytes
Xenopus oocytes utgjør et heterologøst uttrykksystem som vanligvis brukes til å studere celle- og proteinfunksjon. Tidligere studier har vist at kolesterolet til fosfolipid molar forholdet i Xenopus oocytes er 0,5 ± 0,1³⁶. På grunn av dette iboende høye nivået av kolesterol, er det utfordrende å øke innholdet av kolesterol i dette systemet, men kan oppnås ved hjelp av dispersjoner laget av membranfolipider og kolesterol. Fosfolipidene som vi har valgt for dette formålet, ligner på de som brukes til å danne kunstige planar lipidbilag og inkluderer L-α-fosfatidyletanolamin (POPE) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), som beskrevet i protokollseksjonen. Denne tilnærmingen kan resultere i > 50% økning i kolesterolinnhold (Se Representative Results seksjon, Figur 2).

En alternativ tilnærming til berikende Xenopus oocytes med fosfolipid-baserte dispersjoner innebærer bruk av cyklodextrin mettet med kolesterol, som ligner på måten vev og celler er beriket. Vi har imidlertid funnet denne tilnærmingen til å være av lav reproduserbarhet og effektivitet, med et gjennomsnitt på ~ 25% økning i kolesterolinnhold. Dette skyldes muligens den ulike lastekapasiteten til disse to tilnærmingene (se avsnittet Representative Results, figur 3). I motsetning har det blitt vist at bruk av cyklodekstrin for å tømme kolesterol fra Xenopus oocytter kan resultere i en ~ 40% reduksjon i kolesterolinnhold³⁶.

Her fokuserer vi på kolesterol berikelse av pattedyrvev og celler gjennom bruk av cyklodxtrin mettet med kolesterol, og av Xenopus oocytter ved hjelp av liposomer. Begge tilnærminger kan utnyttes for å avgrense effekten av økte nivåer av kolesterol på proteinfunksjon. Mekanismene for kolesterolmodulering av proteinfunksjon kan innebære direkte interaksjoner⁸ og/eller indirekte effekter⁹. Når kolesterol påvirker proteinfunksjon via direkte interaksjoner, er effekten av en økning i kolesterolnivået på proteinaktivitet sannsynligvis uavhengig av celletype, uttrykkssystem eller berikelsestilnærming. For eksempel brukte vi disse to tilnærmingene for å bestemme effekten av kolesterol på G-protein gated innover rette kalium (GIRK) kanaler uttrykt i atriemyocytter³⁷, hippocampal nevroner^32,38, HEK293³⁹ celler, og Xenopus oocytes^32,37. Resultatene oppnådd i disse studiene var konsistente: i alle tre typer pattedyrceller og i amfibier oocytes kolesterol upregulated GIRK kanalfunksjon (se Representative Resultater seksjon, Figur 4,for hippocampal nevroner og tilsvarende eksperimenter i Xenopus oocytes). Videre var observasjonene gjort i disse studiene også i samsvar med resultatene av studier utført i atriemyocytter^37,40 og hippocampal nevroner^32,38 nylig isolert fra dyr utsatt for et høyt kolesterol diett⁴⁰. Spesielt, kolesterol berikelse av hippocampal nevroner ved hjelp av MβCD reversert effekten av atorvastatin terapi som brukes for å løse virkningen av høyt kolesterol diett både på kolesterolnivåer og GIRK funksjon³⁸. I andre studier undersøkte vi effekten av mutasjoner på kolesterolfølsomheten til den indre korrigering av kaliumkanalen Kir2.1 ved hjelp av både Xenopus oocytes og HEK293 celler⁴¹. Igjen var effekten av mutasjonene på følsomheten til kanalen lik i de to systemene.

Anvendelsene av begge berikelsesmetoder for å bestemme virkningen av forhøyede kolesterolnivåer på molekylær, cellulær og organfunksjon er mange. Spesielt er bruk av cyclodextrin-kolesterolkomplekser for å berike celler og vev svært vanlig i stor grad på grunn av spesifisiteten. Nylige eksempler på denne tilnærmingen inkluderer bestemmelse av virkningen av kolesterol på HERG kanalaktivering og underliggende mekanismer⁴², oppdagelsen av at kolesterol aktiverer G protein koblet reseptor Glattet for å fremme Hedgehog signaliserer⁴³, og identifisering av rollen av kolesterol i stamcelle biomekanikk og adipogenese gjennom membran-assosiert linker proteiner⁴⁴. I vårt eget arbeid benyttet vi pattedyrvevberikelse med MβCD:kolesterolkompleks for å studere effekten av kolesterolberikelse på grunnleggende funksjon og den farmakologiske profilen til kalsium- og spenningsinngjerdede kanaler med stor ledningsevne (BK, MaxiK) i vaskulær glatt muskel^35,45,46. I andre studier brukte vi fosfolipidbasert dispersjonstilnærming for berikende Xenopus oocytter med kolesterol for å bestemme rollene til forskjellige regioner i Kir2.1 og GIRK kanaler i kolesterol følsomhet^41,47,48,49, samt å bestemme antatt kolesterol bindende steder i disse kanalene^32,50,51.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer med dyr ble utført ved University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Omsorg for dyr og eksperimentelle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee of the UTHSC, som er en institusjon akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. 1. Berikelse av vev og celler ved hjelp av metyl-β-cykloderkstrin mettet med kolesterol MERK: Kolesterolberikelsesp…

Representative Results

Bruken av cyclodextrin mettet med kolesterol som et middel for berikende vev og celler med kolesterol er godt etablert. Her demonstrerer vi først anvendelsen av denne mye brukte tilnærmingen for å berike rottecerebralarterier med kolesterol ved hjelp av MβCD mettet med kolesterol. Figur 1A viser et eksempel på et avbildet cerebral arterie glatt muskellag og demonstrerer den konsentrasjonsavhengige økningen i filipin-assosiert fluorescen…

Discussion

Metoder for å berike pattedyrvev og celler og Xenopus oocytter med kolesterol utgjør et kraftig verktøy for å undersøke effekten av forhøyede kolesterolnivåer på individuelle molekylære arter, på komplekse makromolekylære systemer (f.eks proteiner), og på cellulær og organfunksjon. I denne artikkelen har vi beskrevet to komplementære tilnærminger som letter slike studier. Først beskrev vi hvordan å berike vev og celler med kolesterol ved hjelp av MβCD mettet med kolesterol. Vi viste at i cerebr…

Materials

Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Invitrogen	A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set	Thermo Scientific	23208
Brain PE 25Mg in Chloroform	Avanti Lipids	840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform	Avanti Lipids	840034C
Cholesterol 100Mg Powder	Sigma	C8667
KCl	Fisher	P217
Trizma base	Sigma	T6066
HEPES	Corning	61-034-RO
MgCl2	Fisher	M33
NaCl	Fisher	S271
KH2PO4	Fisher	P285
MgSO4	EMD Chemicals	MX0070-1
EDTA	VWR	E177
Dextrose Anhydrous	Fisher	BP350
NaHCO3	Sigma	S6014
CaCl2	Sigma	C3881
Blood Gas Tank	nexAir
NaOH	Fisher	S318
1.5mL tubes	Fisher	S35818
Gastight Syringe 100uL	Hamilton	1710
Microliter Syringe 25uL	Hamilton	702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube	Pyrex	8120-12
Chloroform	Fisher	C298
Support Stand	Homescience Tools	CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong	Homescience Tools	CE-CLPUNIV
Sonicator	Laboratory Supplies	G112SP1G
3D rotator mixer	Benchmark Scientific	B3D 1308
96 well plate	Sigma	BR781602
N2 gas	nexAir
Glass beakers 40ml-1L	Fisher	02-540
Ice Machine	Scotsman	CU1526MA-1
Ice bucket	Fisher	50-136-7764
1X PBS	Corning	21-031-CM
TritonX	Fisher	BP151-100
Sonic Dismembrator	Fisher	Model 100
Eppendorf microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Amber bottles	Fisher	03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets	FIsher	13-678-4A
Parafilm	FIsher	50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator	FIsher	97-990E
Oocytes	Xenoocyte™	10005
Rat	Envigo	Sprague Dawley	weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma	C4555
Water bath incubator with shaker	Precision	51221080	Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin	Sigma	SAE0088-1ML
DMSO	Fisher	BP231
Paraformaldehyde 4%	Mallinckrodt	2621
DI H2O	University DI source
ProLong Gold antifade reagnet	Invitrogen	P10144
Microslides 75x25mm Frosted	Diagger	G15978A
Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Microscope Coverslip	Diagger	G15972B
Clear nail polish	Revlon	771 Clear
Labeling Tape	Fisher	15-901-20F
Securline Lab Marker II	Sigma	Z648205-5EA
BD 10mL Syringe	Fisher	14-823-16E
1.2 μm syringe filter	VWR	28150-958
KimWipes	Fisher	06-666A
pH probe	Sartorus	py-p112s
pH meter	Denver instrument	Model 225
70% ETOH	Pharmco	211USP/NF
Timer	Fisher	02-261-840
Steno book	Staples	163485