Поколение мозаичных органоидов дифференциальной трипсинизации
Summary
Мэммарийская железа представляет собой двухслойную структуру, состоящую из внешних миоэпителиальных и внутренних светящихся эпителиальных клеток. Представлен протокол для подготовки органоидов с использованием дифференциальной трипсинизации. Этот эффективный метод позволяет исследователям отдельно манипулировать этими двумя типами клеток, чтобы исследовать вопросы, касающиеся их роли в форме и функции молочной железы.
Abstract
Органоиды предлагают самоорганизующиеся, трехмерные структуры тканей, которые повторяют физиологические процессы в удобстве блюда. Мюринная молочная железа состоит из двух различных эпителиальных клеточных отсеков, обслуживающих различные функции: внешний, сократительный миоэпителиальный отсек и внутренний, секреторный светящийся отсек. Здесь мы описываем метод, с помощью которого клетки, составляющие эти отсеки, изолированы, а затем объединены для исследования их индивидуального вклада в родословную для морфогенеза молочной железы и дифференциации. Метод прост и эффективен и не требует сложных технологий разделения, таких как флуоресценция активированной сортировки клеток. Вместо этого, мы урожай и ферментативно переварить ткани, семена эпителия на приверженных тканях культуры блюда, а затем использовать дифференциальной трипсинизации отделить миоэпителия от светящихся клеток с й90% чистоты. Клетки затем покрываются ввнеклеточной матрицы, где они организуются в двухслойные, трехмерные (3D) органоиды, которые могут быть дифференцированы для производства молока после 10 дней в культуре. Чтобы проверить влияние генетических мутаций, клетки могут быть собраны из диких типов или генетически модифицированных моделей мыши, или они могут быть генетически манипулировать до 3D культуры. Этот метод может быть использован для генерации мозаичных органоидов, которые позволяют исследования функции генов именно в светящейся или миоэпителиальной отсеке.
Introduction
Мэммарийская железа (MG) представляет собой дерево-как, трубчатая эпителиальная структура встроенных в адипоцит богатых стромы. Двухслойный протоковый эпителий включает в себя внешний, базальный слой сократительных, миоэпителиальных клеток (MyoECs) и внутренний слой светящихся, секреторных эпителиальных клеток (LECs), опоясывая центральный просвет1. Во время лактации, когда внешние MyoECs контракт выжать молоко из внутренних альвеолярных LECs, MG претерпевает многочисленные изменения, которые находятся под контролем факторов роста (например, EGF и FGF) и гормоны (например, прогестерон, инсулин и пролактин). Эти изменения вызывают дифференциацию специализированных структур, альвеолы, которые синтезируют и выделяют молоко во время лактации1. Мэммарий эпителия может быть экспериментально манипулировать с помощью методов, в которых либо эпителиальной ткани фрагменты, клетки, или даже одной базальной клетки пересаживаются в принимающей молочной жировых прокладок, предочищенные эндогенной молочной паренхии, и позволили вырасти, чтобы восстановить весь, функциональный эпителиевдерево дерево2,3,,5.5 Трансплантация является мощным методом, но это отнимает много времени и невозможно, если мутация приводит к ранней эмбриональной летальности (до E14), что предотвращает спасение трансплантации молочной анлечы. Кроме того, исследователи часто хотят исследовать роль двух различных отсеков, которые являются производными от линии ограниченных клеток-прародителей. В то время как технология Cre-lox позволяет дифференциальные генетические манипуляции MyoECs и LECs, это также трудоемкое и дорогостоящее предприятие. Таким образом, с 1950-х годов, исследователи использовали в пробирке молочных органоидов в качестве относительно простого и эффективного способа решения вопросов, касающихся структуры ткани молочной железы и функции6,7.
В ранних протоколах, описывающих изоляцию и культуру первичных эпителиальных клеток молочной железы, исследователи обнаружили, что мембранная матрица подвала (BME), состоящая из плазменного сгустка и экстракта куриного эмбриона, была необходима для фрагментов MG, выращенных на блюде6. В последующие десятилетия, внеклеточные матрицы (ECMs, коллаген, и желеобразная белковая матрица, выделяемая клетками саркомы Engelbreth-Holm-Swarm) были разработаны для облегчения 3D-культуры и лучше имитировать среду vivo7,8,9,10. Культивирование клеток в 3D-матрицах выявлено по нескольким критериям (морфология, экспрессия генов и гормональной реакции), что такая микросреда лучше моделиирует в виво физиологических процессов9,10,11,12. Исследования с использованием первичных муринных клеток определили ключевые факторы роста и морфогены, необходимые для длительного обслуживания и дифференциации органоидов13. Эти исследования задали основу для протокола, представленного здесь, и для культуры клеток молочной железы человека, как 3D органоидов, который в настоящее время современный клинический инструмент, позволяющий для обнаружения наркотиков и тестирования на наркотики на пациента образцов14. В целом, органоидный культивирование подчеркивает возможности самоорганизации первичных клеток и их вклад в морфогенез и дифференциацию.
Представлено здесь протокол к культуре мурин эпителии, которые могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини. Дифференциальная методика трипсинизации используется для изоляции MyoECs и LECs, которые состоят из двух различных отсеков ячейки MG. Эти разделенные фракции клетки можно провести генетические манипуляции, чтобы переэкспрессировать или нокдаун генной функции. Потому что родословная-внутренняя, самоорганизация является врожденным свойством молочных эпителиальных клеток15,,16,,17, рекомбинация этих клеточных фракций позволяет исследователям генерировать двуслойные, мозаичные органоиды. Начинаем с ферментативного переваривания жировой ткани, а затем инкубации фрагментов молочной ткани на блюдо культуры тканей на 24 ч(рисунок 1). Фрагменты ткани оседают на полистироловых посудах в виде двухслойных фрагментов с их организацией in vivo: внешний миоэпителиальный слой, окружающий внутренние светящиеся слои. Эта клеточная организация позволяет изоляции внешних MyoECs трипсин-EDTA (0.05%) лечение 3-6 мин с последующим вторым раундом трипсина-ЭДТА (0.05%) лечение, которое отсоединяет оставшиеся внутренние LECs(Рисунок 2). Таким образом, эти типы клеток с различной чувствительностью трипсина изолированы и впоследствии могут быть смешаны и покрыты eCM(рисунок 3). Клетки подвергаются самоорганизации для формирования двухслойных сфер, включающих внешний слой MyoECs, окружающих внутренние LECs. Образование люмен происходит, как клетки растут в среде, содержащей коктейль факторов роста (см. рецепты для роста Medium)13. После 5 дней, органоиды могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини, переключившись на Alveologenesis Medium (см. рецепты и рисунок 3F) и инкубируется еще на 5 дней. Кроме того, органоиды будут продолжать расширяться и ветвиться в рост средних, по крайней мере 10 дней. Органоиды могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции(рисунок 3D-F) или освобождены от ECM с помощью решения восстановления (см. Таблица материалов)и проанализированы с помощью других методов (например, иммуноблот, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлен метод, в которых подробно описывается, как исследователи могут генерировать 3D органоидные культуры с помощью первичных клеток МГ. Разница между этим и другими протоколами заключается в том, что мы подробно метод, чтобы отделить два, различные отсеки ячейки MG: внешние ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Бена Абрамса за техническую помощь и основную поддержку со стороны Калифорнийского университета, Института биологии стволовых клеток (UCSC). Мы благодарим Сьюзан Стром и Билл Сакстон за использование их Solamere спиннинг дискconfocal микроскоп. Эта работа была частично поддержана грантами UCSC от Медицинского института Говарда Хьюза через программу стипендий Джеймса Х. Гиллиама для расширенного обучения (S.R.), от NIH (NIH GM058903) за инициативу по максимизации развития студентов (H.M.) и от Национальный научный фонд для аспирантуры стипендий (O.C. DGE 1339067) и грант (A18-0370) от UC-Cancer Research Координационный комитет (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Riferimenti
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Biologia dello sviluppo. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
