फ्लोरोसेंटी टैग किए गए एंटीबायोटिक्स शक्तिशाली उपकरण हैं जिनका उपयोग रोगाणुरोधी प्रतिरोध के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख फ्लोरोसेंटी टैग एंटीबायोटिक दवाओं की तैयारी और बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए उनके आवेदन का वर्णन करता है। जांच का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी द्वारा बैक्टीरियल प्रतिरोध (उदाहरण के लिए, एफलक्स) के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक्स बहुउद्देशीय अनुसंधान उपकरण हैं जो अन्य तरीकों पर उनके महत्वपूर्ण लाभ के कारण एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध के अध्ययन के लिए आसानी से उपयोग किए जाते हैं। इन जांचों को तैयार करने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं के अजाइड डेरिवेटिव संश्लेषित किए जाते हैं, फिर क्लिक केमिस्ट्री द्वारा अजाइड-अल्किन डाइपोलर साइक्लोअलावा का उपयोग करके अल्काइन-फ्लोरोफोरस के साथ मिलकर। शुद्धिकरण के बाद, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक की एंटीबायोटिक गतिविधि न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता आकलन द्वारा परीक्षण किया जाता है। बैक्टीरियल संचय का अध्ययन करने के लिए, या तो स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया जा सकता है, जिससे रेडियोधर्मी एंटीबायोटिक डेरिवेटिव पर निर्भर तरीकों की तुलना में बहुत सरल विश्लेषण की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग बैक्टीरिया के भीतर स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो प्रतिरोधी प्रजातियों में होने वाली कार्रवाई के तरीके और परिवर्तनों के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है। रोगाणुरोधी प्रतिरोध के अध्ययन में फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच का उपयोग भविष्य के विस्तार के लिए बहुत क्षमता के साथ एक शक्तिशाली तरीका है ।
रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) एक बढ़ता संकट है जो दुनिया भर में मानव स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा बन गया है । सबसे एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध की सूचना दी गई है, और सभी चिकित्सकीय उपलब्ध दवाओं के लिए प्रतिरोधी बैक्टीरिया की वजह से संक्रमण उभर रहे हैं । एएमआर के उदय का मुकाबला करने के लिए, हमें इस बहुआयामी घटना और एंटीबायोटिक दवाओं और बैक्टीरिया के बीच अंतर्निहित तंत्र और बातचीत के बारे में अपनी समझ बढ़ाने की जरूरत है । एक पहलू है कि ऐतिहासिक रूप से खराब समझा गया है बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक दवाओं की परमीशन, संचय और efflux की घटना के साथ है । यह ज्ञान नई दवाओं को डिजाइन करने और प्रतिरोध के तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण है। इसलिए, यह एएमआर अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
एंटीबायोटिक एकाग्रता को मापने के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण किए जा सकते हैं: दवा को सीधे मापने या क्वांटिफिकेशन की सुविधा के लिए डिज़ाइन किए गए मोईटी के साथ टैगिंग करना। हालांकि एंटीबायोटिक टैगिंग का पता लगाने में सुधार, यह इस तरह के रोगाणुरोधी गतिविधि और स्थायित्व के रूप में दवा की जैविक गतिविधि, बेफिक्र कर सकते हैं । यह अनटैग तरीकों के लिए कोई समस्या नहीं है; हालांकि, पता लगाना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। पिछले कुछ वर्षों में, तकनीकी प्रगति के कारण बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग करके अनुसंधान में तेजी आई है ताकि बैक्टीरिया1,2,3,4,5,6,7में एंटीबायोटिक एकाग्रता को सीधे माप सके । इन अध्ययनों से पता चला है कि विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया में इंट्रासेलुलर संचय का अध्ययन करना संभव है, जिसमें ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है। तब अणु की परगम्यता को गतिविधि से जोड़ा गया है और इसका उपयोग औषधि विकास2,3,4को सूचित करने के लिए किया जाता है, हालांकि संचय और लक्षित गतिविधि5को सीधे जोड़ते समय सावधानी बरती जानी चाहिए । एमएस विकास से पहले, केवल एंटीबायोटिक्स जिनकी एकाग्रता को सीधे मापा जा सकता है, वे थे जो आंतरिक फ्लोरेसेंस, जैसे टेट्रासाइक्लिन और क्विनोलोन8,9,10,11रखने वाले थे। हालांकि स्पष्ट रूप से दायरे में सीमित, संचय और प्रभावलों की जांच की गई और मात्रा निर्धारित की गई, जो फ्लोरेसेंस-आधारित क्वांटिफिकेशन की उपयोगिता को दर्शाती है।
टैग एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कई दशकों से रेडियोधर्मी और फ्लोरोसेंट टैग के साथ वितरण, कार्रवाई के तरीके और प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए किया गया है। रेडियो टैग जांच लगभग माता पिता के यौगिक के समान होने का लाभ है, इसलिए जैविक गतिविधि काफी अलग होने की संभावना नहीं है । एंटीबायोटिक दवाओं में इन तत्वों की प्रमुखता के कारण 3एच, 14सी और 15एन जैसे आइसोटोप का अक्सर उपयोग किया जाता रहा है, और विभिन्न प्रकार के एंटीबायोटिक मचानों की जांच1,10,12,13की की गई है। जबकि रेडियो-जांच का पता लगाना सरल है, कई साजो-सामान की चिंताएं हैं (उदाहरण के लिए, सुरक्षा, आइसोटोप आधा जीवन) जिन्होंने इस दृष्टिकोण के उपयोग को सीमित कर दिया है। एक और रणनीति फ्लोरोसेंट-टैग एंटीबायोटिक दवाओं है। इन जांचों का उपयोग एमएस की तुलना में सरल प्रौद्योगिकी का उपयोग करके और विकिरण8की साजो-सामान की समस्याओं के बिना माता-पिता की दवा के वितरण और कार्रवाई और प्रतिरोध के तरीकों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के लिए मुख्य दोष यह है कि एंटीबायोटिक दवाओं आम तौर पर अपेक्षाकृत छोटे अणु हैं, इसलिए एक फ्लोरोसेंट moiety की शुरूआत एक महत्वपूर्ण रासायनिक परिवर्तन बन गया है । यह परिवर्तन फिजियोकेमिकल गुणों और जीवाणुरोधी गतिविधि को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, माता-पिता एंटीबायोटिक के परिणाम प्रतिनिधि उत्पन्न करने के लिए इन कारकों का आकलन करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए।
इस कार्य में, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं के संश्लेषण, मूल्यांकन और उपयोग के लिए एक विधि वर्णित है, जैसा कि हमारे पिछले प्रकाशनों14,15,16में है। पिछले काम के माध्यम से, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं की एक संख्या तैयार किया गया है और प्रयोजनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया (पत्थर एट अल8देखें) । जैविक गतिविधि को प्रभावित करने की संभावना को कम करने के लिए, इस काम में बहुत छोटे फ्लोरोफोरस का उपयोग किया जाता है: नाइट्रोबेंजोक्साडिज़ोल (एनबीडी, ग्रीन) और 7-(डिमेथिलामिनो)-2-ऑक्सो-2 एच-क्रोमन-4-वाईएल (DMACA, नीला)। इसके अलावा, माइक्रोब्रोथ कमजोर पड़ने वाले न्यूनतम अवरोध एकाग्रता (एमआईसी) परख का उपयोग करके जीवाणुरोधी गतिविधि के आकलन का वर्णन किया गया है, ताकि गतिविधि पर संशोधनों के प्रभाव को मापा जा सके। इन फ्लोरोसेंटी टैग की गई जांच का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख, प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी में किया जा सकता है। संभावित अनुप्रयोगों की सीमा है जहां फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं का लाभ निहित है । सेलुलर संचय को केवल एमएस का उपयोग करके कुछ संभव नहीं है, केवल एमएस का उपयोग करके मात्रानिर्धारित, वर्गीकृत और कल्पना की जा सकती है। यह आशा की जाती है कि फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग के माध्यम से प्राप्त ज्ञान प्रतिरोध की हमारी समझ में सहायता करेगा, और AMR के खिलाफ लड़ाई ।
एक सफल फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच का निर्माण सावधानीपूर्वक योजना और माता पिता की दवा के SAR के विचार के साथ शुरू करना चाहिए । यदि एसएआर को ज्ञात या पूरी तरह से पता नहीं लगाया जाता है, तो एक ऐसी साइट खोजने के लिए कई विकल्पों का परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है जिसे जैविक गतिविधि को समाप्त किए बिना चुनिंदा रूप से संशोधित किया जा सकता है। एक बार साइट/एस की पहचान कर ली गई है, तो कार्रवाई की जैविक साइट और निष्क्रिय फ्लोरोफोर के बीच स्टेरिक स्पेसिंग प्रदान करने के लिए लिंकर मोइटी की स्थापना अक्सर आवश्यक होती है । ध्यान रखा जाना चाहिए कि एंटीबायोटिक के लिए लिंकर संलग्न करने के लिए इस्तेमाल की प्रतिक्रिया एक जैव स्थिर कार्यात्मक समूह छोड़ देता है, परहेज, उदाहरण के लिए, एस्टर है कि वीवो में esterases द्वारा दरार के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । एंटीबायोटिक के फार्माकोडायनामिक और फार्माकोकिनेटिक प्रोफाइल के आधार पर, एक साधारण एल्किल लिंकर का उपयोग किया जा सकता है, या किसी अन्य में पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) लिंकर जैसे कम लिपोफिलिक विकल्प पर विचार किया जाना चाहिए। लिंकर संलग्न के साथ, जीवाणुरोधी गतिविधि का आकलन किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रासंगिक बैक्टीरिया के खिलाफ एमआईसी मूल यौगिक के समान हैं।
इस काम में, हम कई कारणों से, ह्यूगसेन अजाइड-अल्किन [3 +2] डाइपोलर साइक्लोड (क्लिक केमिस्ट्री, देखें फिगर 1)के उपयोग की सलाह देते हैं, जो कई कारणों से फ्लोरोफोर को एंटीबायोटिक से लिगेट करते हैं। क्लिक करें प्रतिक्रियाएं अत्यधिक चयनात्मक हैं, जिसका अर्थ है कि एंटीबायोटिक पर प्रतिक्रियाशील समूहों की सुरक्षा आवश्यक नहीं है, और आगे, प्रतिक्रिया एक स्थिर, जैव संगत ट्राइजोल मोईटी छोड़ देती है। अजाइड घटक हमारी प्रक्रियाओं में एंटीबायोटिक भाग के लिए पेश किया जाता है, क्योंकि यह आम तौर पर एक alkyne की शुरूआत की तुलना में संरचनात्मक प्रकार की एक किस्म के साथ अधिक आसानी से पूरा किया जाता है । दो alkyne-व्युत्पन्न फ्लोरोफोरस के संश्लेषण यहां वर्णित हैं, हालांकि दूसरों को अगर वांछित पता लगाया जा सकता है । एनबीडी और DMACA अपने छोटे आकार के कारण चुना गया था, सेल प्रवेश और लक्ष्य बातचीत के साथ हस्तक्षेप की संभावना को कम । क्लिक करें प्रतिक्रिया ही कॉपर उत्प्रेरक का उपयोग करके किया जाता है, जहां या तो सीयू2 + (क्यूएसओ4,एक एस्कोबिक एसिड कम करने वाले एजेंट के साथ) या सीयू+ (कुआई) का उपयोग शुरुआती अभिकर्मक के रूप में किया जा सकता है। शुद्धिकरण(चित्रा 2) केबाद, एमआईसी को फिर अजाइड के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए। यहां तक कि फ्लोरोफोर पसंद और लगाव की साइट पर सावधानीपूर्वक विचार करने के साथ, यह संभव है कि खराब एंटीबायोटिक गतिविधि देखी जाएगी। हालांकि, इसका मतलब यह नहीं है कि एक निष्क्रिय जांच उपयोग के बिना है । जैसा कि टीएमपी जांच के साथ दिखाया गया है, गरीब जीवाणुरोधी गतिविधि वाले यौगिक अभी भी माता-पिता की दवा के समान लक्ष्य से बांध सकते हैं। यह कार्रवाई के तरीके और घटनाओं की परीक्षा के तरीके पर अध्ययन सक्षम कर सकता है जिससे प्रतिरोध, जैसे कि efflux।
जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित है, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा बैक्टीरियल लेबलिंग का विश्लेषण करना संभव है या तो एक साधारण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री परख(चित्रा 3)या प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 4)का उपयोग करके। दोनों विधियां सेलुलर संचय की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम हैं, और कोशिकाओं को लायसेटिंग करके और lysate में फ्लोरेसेंस स्थानीयकरण की जांच करके, इंट्रासेलर संचय का आकलन करना संभव है। इस प्रोटोकॉल में सेल लिसिस के लिए लिसोज़िम के इस्तेमाल का वर्णन किया गया है, क्योंकि यह एक रैपिड, यूनिवर्सल तकनीक है। ग्लाइसिन-एचसीएल7के साथ रात भर इलाज जैसी अन्य लाइसिस स्थितियों का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इस तकनीक का उपयोग करके, एंटीबायोटिक सेलुलर संचय पर एफलक्स के प्रभाव का अध्ययन करना संभव है, जो प्रतिरोध का एक प्रमुख तंत्र है। यदि एफलक्स वास्तव में बैक्टीरिया में मौजूद है, तो इंट्रासेलुलर संचय की कमी देखी जाएगी, हालांकि इसे सीसीएसपी जैसे एफलक्स अवरोधक का उपयोग करके बचाया जा सकता है।
माइक्रोस्कोपी भी नेत्रहीन विभिन्न बैक्टीरिया में जांच स्थानीयकरण का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, कार्रवाई के मोड पर जानकारी जुटाने, और संभवतः भी प्रतिरोध (प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्रा 5 देखें) । बैक्टीरिया के भीतर स्थानीयकरण देखने के लिए, एक उच्च संकल्प कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है, सिम (संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी), एसआर-सिम (सुपररिज़ॉल्यूशन-सिम), एयरिकस्कैन, या एसटीईडी (उत्तेजित उत्सर्जन कमी) जैसी क्षमताओं से लैस है। इसके अलावा, उच्च प्रदर्शन कवर स्लिप का उपयोग किया जाना चाहिए, और एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी, ज़ेन या इमरिस) पर पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण किया जाना चाहिए। जांच के स्थानीयकरण की तुलना उन रंगों से की जाती है जो विशिष्ट आर्किटेक्चर को दाग देते हैं, जैसे कि होचस्ट-33342 (नीला, न्यूक्लिक एसिड), सिको-9 (हरा, न्यूक्लिक एसिड), और एफएम4-64एफएक्स (लाल, झिल्ली)। फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक से मेल खाने के लिए रंगों का चुनाव किया जाना चाहिए, ताकि उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक रंग में न्यूनतम स्पेक्ट्रल ओवरलैप हो। सर्वोत्तम संभव छवियों को प्राप्त करने के लिए, अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, यदि स्लाइड पर बैक्टीरिया की बहुत भीड़ होती है, तो निलंबित गोली का केवल एक हिस्सा लें, फिर अधिक बढ़ते माध्यम के साथ पतला करें। इसके विपरीत, यदि बैक्टीरिया स्लाइड पर बहुत विरल हैं, तो बस अधिक बैक्टीरिया से शुरू करें। इस प्रोटोकॉल में, लाइव सेल इमेजिंग के लिए लाइव सेल (जैसे, साइगेल) के साथ संगत होने वाले थर्मो रिवर्सिबल जेल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह बैक्टीरिया (मोटिवल बैक्टीरिया सहित) को स्थिर करता है, लेकिन अन्य बढ़ते मीडिया या अगारोज का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।
कुल मिलाकर, जैविक रूप से सक्रिय फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक डेरिवेटिव की तैयारी में सामना की जा सकने वाली चुनौतियों के बावजूद, उनके उपयोग की सादगी और उनकी बहुमुखी प्रतिभा इन जांचों को एएमआर में अनुसंधान के लिए आकर्षक उपकरण बनाती है। फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर भविष्य के काम एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है, कैसे वर्तमान एंटीबायोटिक दवाओं काम की हमारी समझ में सुधार, और बेहतर दवाओं के विकास में सहायता ।
The authors have nothing to disclose.
एमआरएलएस को एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार (एपीए) और आणविक जैव विज्ञान अनुसंधान उन्नति पुरस्कार के लिए एक संस्थान द्वारा समर्थित किया जाता है। वानिडा फेसांग को यूक्यू इंटरनेशनल स्कॉलरशिप (यूक्यूआई) और आईएमबी पोस्टग्रेजुएट अवार्ड (IMBPA) ने समर्थन दिया था । मैक एक एनएचएमआरसी सिद्धांत अनुसंधान फेलो (APP1059354) है और क्वींसलैंड विश्वविद्यालय में एक आंशिक प्राध्यापक अनुसंधान फेलो नियुक्ति भी रखती है, जिसमें इंफ्लाज़ोम लिमिटेड के सीईओ के रूप में उनका शेष समय है, जो भड़काऊ रोग में नैदानिक अनमेट जरूरतों को संबोधित करने के लिए दवाओं का विकास करने वाली कंपनी है। MATB वेलकम ट्रस्ट सामरिक अनुदान WT1104797/Z/14/Z और NHMRC विकास अनुदान APP1113719 द्वारा भाग में समर्थित है । माइक्रोस्कोपी ऑस्ट्रेलियन कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (ACRF) /आणविक जैव विज्ञान कैंसर जीव विज्ञान इमेजिंग सुविधा के लिए संस्थान में किया गया था, जो ACRF के समर्थन से स्थापित किया गया था ।
3-(dimethylamino)phenol | Alfa-Aesar | B23067 | |
4-chloro-7-nitro-benzofuran | Sigma-Aldrich | 163260-5G | |
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane | Merck | UFC501096 | |
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10×250 mm) | Waters | 186008205 | |
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) | Waters | 186003734 | |
Bruker Avance 600 MHz spectrometer | Bruker | ||
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge | Buchi | BUC145152103 | |
CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
Celite 545 | Sigma-Aldrich | 22140-5KG-F | |
Cygel | ABCAM | Ab109204 | |
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope | Zeiss | ||
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain | Life Technologies Australia Pt | F34653 | |
Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise | CHRIST | ||
Gilson HPLC 2020 | Gilson | ||
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 | Hettich | ||
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) | Schott/Zeiss | 474030-9000-000 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – Fluo | Life Technologies Australia Pt | H21492 | |
LB | AMRESCO | J106 | |
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation | Leica | ||
Lysozyme from chicken egg white lyophilized powder |
Sigma-Aldrich | L6876 | |
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted | Becton Dickinson | 212322 | |
Propargylamine | Sigma-Aldrich | P50900-5G | |
Reveleris GRACE MPLC | Buchi | ||
Shimadzu LCMS-2020 | Shimadzu | ||
Sigma 1-15 Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | ||
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) | Merck | 1093859025 | |
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Life Technologies Australia Pt | S34854 | |
TECAN Infinite M1000 PRO | TECAN |