צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.

Abstract

לתרביות תאים של הקרנית אנדותל יש נטייה לעבור מעבר אפיתל-אל-mesenchymal (חובש) לאחר אובדן של קשר תא לתאים. צוות החירום מקטין את התאים כאשר הוא מפחית את יכולתם ליצור שכבת בוגרת ופונקציונלית. כאן, אנו מציגים שיטה להקמת ולתת האנושית וכבשים הקרנית מתרביות תאים אנדותל ממזער את אובדן של מגע תא אל התא. הקרום של ממברנה של הקרנית אנדותל/הורד באמת נלקח מקרניות תורמות וממוקמות בתוך התרבות הרקמה בתנאים המאפשרים לתאים להגר באופן קולקטיבי אל משטח התרבות. לאחר הקמת תרבות, האקסוצמחים מועברים לצלחות טריות כדי ליזום תרבויות חדשות. Dispase II משמש כדי להרים בעדינות גושים של תאים מתוך לוחיות התרבות רקמות עבור subculturing. תרביות תאים של הקרנית אנדותל אשר הוקמו באמצעות פרוטוקול זה מתאימים להעברת לממברנות ביואטימי כדי לייצר שכבות תא רקמות מהונדסים להשתלה בניסויים בבעלי חיים. מכשיר בהזמנה מותאמת אישית לתמיכה ביואגמי-ממברנות במהלך תרבות הרקמה מתואר ודוגמה של השתלת רקמה מהונדסים מורכב שכבה של תאי הקרנית אנדותל ושכבה של תאים סטרומה הקרנית משני צדי סוג של קולגן אני הממברנה מוצג.

Introduction

הקרנית היא רקמה שקופה הממוקמת בקדמת העין. הוא מורכב משלוש שכבות עיקריות: שכבת אפיתל על המשטח החיצוני, שכבת משתית אמצעית, ושכבה פנימית בשם הקרנית אנדותל. אנדותל הקרנית הוא מונייר של תאים היושבים על קרום מרתף בשם הקרום של הספר, והוא שומר על השקיפות של הקרנית על ידי ויסות כמות הנוזל המוסיפה את הסטרומה מההומור המשמש כבסיס. יותר מדי נוזל בתוך משתית גורם נפיחות הקרנית, אטימות אובדן ראייה. לכן האנדותל חיוני לשמירה על הראייה.

האנדותל הקרנית יכולה להיות מתפקדת בגלל מספר סיבות, כולל הזדקנות, מחלה ופציעה, והטיפול הנוכחי היחיד הוא ניתוח השתלה. במהלך ניתוח זה, מסירים האנדותל והממברנה של המטופל את הקרנית ומוחלפים בשתל של אנדותל והקרום של האישה המתקבלת מקרנית של התורם. שתלי אנדותל רבים מכילים גם שכבה דקה של רקמת סטרומה כדי לסייע לטיפול המצורף הקרנית המארחת¹.

ברחבי העולם, הביקוש של רקמת תורם הקרנית לניתוחי השתלה גדול יותר מהכמות שניתן לספק על ידי בנקים עין². יש אפוא כונן לפתח השתלות רקמה הנדסה אנדותל שיכול לשמש כדי להקל על הגרעון הזה³. הרציונל של זה מבוסס על העובדה כיום, אנדותל מן הקרנית הפרט יכול להיות רק מועבר לחולה יחיד, עם זאת, אם התאים האנדותל הקרנית התרחבו הראשון וגדל על ביוקפלי החומר בתרבית רקמות, הם יכולים לשמש לטיפול בחולים מרובים.

האתגרים העיקריים כי צריך להיות ממוען לפני השתלת רקמות מהונדסים הקרנית אנדותל להפוך אופציה אפשרית עבור מנתחים כוללים: (1) הקמת טכניקות להרחבת תאים אנדותל הקרנית באיכות גבוהה להפקת בוגרת ו הקרנית פונקציונלי שכבות תא אנדותל מבחנה, ו (2) הקמת טכניקות לגידול התאים על מקפלים ביוטומטל לייצר שתלי רקמות מהונדסים כי הם שווים, או טוב יותר, שתלי קרנית נגזר התורם המשמשים כיום.

תאים הקרנית אנדותל יש פוטנציאל מתרבים נמוך מאוד vivo אבל יכול להיות מגורה כדי לחלק בתוך מבחנה⁴. למרות זאת, יש להם נטייה חזקה לעבור במעבר האפיתל-אל-מסנצ’יאל (חובש), המפחית את יכולתם ליצור שכבת אנדותל בוגרת ופונקציונלית. הגורמים המוכרים לחובשים בתאי הקרנית של הקרניות כוללים חשיפה לגורמי גדילה מסויימים ואובדן של מגע תא-אל-תא⁵. זה כמעט בלתי נמנע כי הקרנית התרביות התאים האנדותל כי הם מנוכה אנזימטי במהלך תת-תרבות יעברו שינויים הקשורים פרמדיק. כאן, אנו מציגים שיטה של תרבות התא עבור תאים אנושיים או כבשים הקרנית לתאי שנועד למזער את ההפרעה של הקשר תא אל התא במהלך בידוד, בשלבים הרחבה ותת-בית, כדי להפחית את הפוטנציאל של חובש. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד רקמות הנדסה שתלים הדומות לקרנית הנגזרת של ממברנה/שתלי רקמת העור/מסטרומה של הרקמה ניתן לייצר על ידי גידול שכבות התא מתורבת בשני הצדדים של קרום ביומטריה במכשיר מותאם אישית הרכבה.

Protocol

הקרנית האנושית עם הסכמת התורם למחקר התקבלו מהבנק עין קווינסלנד ובשימוש עם אישור האתיקה מתחנת המטרו דרום החולים וועדת המחקר האנושי של שירות הבריאות (HREC/07/QPAH/048). קרניות כבשים הושגו בעלי חיים מורדמים במכון המחקר הרפואי הראסטון של אוניברסיטת קווינסלנד תחת הסכם שיתוף רקמות. 1. הכ?…

Representative Results

השיטה לבידוד והרחבה של תאי הקרנית מתוך הקרניות האנושיות או הכבשים מסוכמות באיור 1 ובאיור 2. רוב האקכורים הנגזרים מן הקרניות 1 עד 2-בן כבשים או תורמים אנושיים של פחות מ -30 שנים של גיל יהיה לצרף את מארז מצופה לוחיות העור בתוך שבוע, עם זאת, זה לא יוצא דופן לגלות כי ?…

Discussion

אתגר טכני משמעותי הקשור להקמת והרחבת תאי הקרנית האנושית של הקרניות מונע מצוות החירום להתרחש בתרבויות. החובשים יכולים להיות מופעלות בתאי הקרנית בתוך התאים על ידי אובדן מגע תא אל התא, אך רוב הפרוטוקולים של תרבות התא עבור תאים אלה כרוך דיסוציאציה אנזימטית לתאים בודדים במהלך בידוד ותת-תרבות<s…

Materials

Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.