JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

Dextran маркировки и поглощения в живых и функциональных Murine кохлеарных волосяных клеток

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Здесь мы представляем метод визуализации поглощения 3 kDa Техас Красная маркировка dextran в слуховых волосяных клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Кроме того, декстран т 3-10 кДа может быть использован для изучения эндоцитоза волос и поддерживающих клеток органа Корти.

Abstract

Канал механотрансдукции волосковых клеток (MET) играет важную роль в слухе. Тем не менее, молекулярная идентичность и структурная информация MET остаются неизвестными. Электрофизиологические исследования волосковых клеток показали, что канал MET имеет большую проводимость и проницаем к относительно большим флуоресцентным катионным молекулам, включая некоторые красители из стирила и техасские антибиотики аминогликозид. В этом протоколе мы описываем метод визуализации и оценки поглощения флуоресцентного декстранта в волосяных клетках органа корти-эксрастенив, которые могут быть использованы для оценки функциональных каналов MET. Мы обнаружили, что 3 kDa Техас Красная маркировка dextran специально этикетки функциональных слуховых волосяных клеток после 1-2 ч инкубации. В частности, 3 kDa dextran маркирует два коротких стереоционных ряда и накапливается в клеточном теле в диффузном рисунке при появке функциональных каналов MET. Дополнительная везикум-подобная картина маркировки наблюдалась в клеточном теле волосковых клеток и окружающих поддерживающих клеток. Наши данные показывают, что 3 kDa Техас-Красный dextran может быть использован для визуализации и изучения двух путей для клеточного поглощения красителя; волосяных клеток конкретных входных маршрутов через функциональные каналы MET и эндоцитоза, шаблон также доступны для больших dextran.

Introduction

Волосковые клетки внутреннего уха являются сенсорными клетками, которые обнаруживают звук и скрытые механически стимулы в электрических сигналах, которые в конечном счете интерпретируются нашим мозгом. Эти клетки имеют лестницу формы пучок из трех рядов actin основе нити, известный как стереосциты, которые выступают из их apical области1,2. Механические стимулы отклонять стереоцильные нити к длинному ряду и вызвать открытие механотрансдукции (MET) каналов3. Открытие каналов MET приводит к притоку катионов, которые деполяризуют клетку и, следовательно, сигнализирует о высвобождении синепсных пузырьков в базальной области волосяной клетки.

Биофизические свойства канала MET, необходимые для слуха, были широко охарактеризованы. Среди других свойств, эти каналы катионные селективного и имеют относительно большую проводимость (150-300 рС в низких Ca2 “4,5,6,7,8,9,10. Примечательно, что большие флуоресцентные молекулы, такие как FM1-43 и Техас Красной маркировкой аминогликозиды являются permeant блокаторы канала MET, в результате чего их накопление в теле волосяных клеток, которые могут быть визуализированы с помощью флуоресценции микроскопии11,12,13,14. И наоборот, молекулярная идентичность и структура канала МЕТ и его проницаемый путь остаются неуловимыми. Все больше экспериментальных данных указывает на то, что трансмембранно-подобный канал белка 1 (TMC1) является компонентом канала MET в зрелых волосковых клетках15,16,17,18,19. Мутации в трансмемембранном канале 1 (TMC1) изменяют свойства канала MET19,20,21,22 и вызывают глухоту. Кроме того, TMC1 локализуется на сайте канала MET18,23 и взаимодействует с наконечником-ссылкой, ответственной за передачу механической силы на канал MET24,25. Кроме того, недавний анализ биоинформатики определил белки TMC как эволюционные, связанные с механочувствительными каналами TMEM63/OSCA белков и TMEM16 белков, семейство кальциевых каналов хлорида и липидных скремблазов26,27,28. Структурная модель TMC1, основанная на взаимосвязи между этими белками, выявила наличие большой полости при белково-липидном интерфейсе27. Эта полость гавани две мутации TMC1, которые вызывают аутосомно-доминантной потери слуха (DFNA36)27,29,30,31,32, и селективной модификации цистеина мутантов для остатков в полости изменить СВОЙСТВА канала МЕТ28, указывая, что он может функционировать как пермяцкий путь канала MET. Большой размер этой предсказанной полости в белках TMC может объяснить способность больших молекул проникать в канал MET. Чтобы проверить предсказание о том, что канал MET содержит необычайно большой проницательный путь и раздвинуть пределы размера полости, наблюдаемые в TMC1, мы разработали протокол для проведения экспериментов по поглощению в органе Эксплансов Корти с более крупной молекулой, 3 kDa dextran флуоресцентно помечены Техас Красный.

Dextran представляет собой сложный разветвленный полисахарид, состоящий из многих молекул D-глюкозы, связанных альфа-1,6 гликозидными связями. Его высокая растворимость в воде, низкая токсичность клеток и биоинертность делают его универсальным инструментом для изучения нескольких клеточных процессов. Кроме того, dextran доступен в широком диапазоне размеров и флуоресцентно помечены флюорофорами нескольких цветов. Флуоресцентно помечены dextrans обычно используются в клетках и ткани проницаемости исследований33,34, для изучения эндоцитоза в нескольких клеточных систем35,36, и для нервной трассировки37,38. В слуховой области, dextran молекулы также были использованы для оценки нарушения клеточного соединения и потери слуховой сенсорной целостности эпителия после воздействия интенсивного шума в органе шиншиллы Корти39,40.

В этой работе мы использовали свойства некоторых из самых маленьких (3 и 10 kDa) флуоресцентных dextrans для выполнения экспериментов поглощения в мурин внутренних волосковых клеток уха и изучить размер проницательного пути внутреннего уха волос ячеек MET канала. Кроме того, мы использовали лазерный сканирование конфокального микроскопа (LSM) 880, оснащенного детектором Airyscan для визуализации и локализации флуоресцентного декесцентного декесцентного на стереосилиях и клеточном теле слуховых волосковых клеток.

Protocol

Уход за животными и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных, которые были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Национального института неврологических расстройств и инсульта…

Representative Results

Мы наблюдали надежную и специфическую маркировку волосковых клеток после 2h инкубации органа Корто высаженных растений из диких типа послеродового дня-6 (P6) мышей с 3 kDa dextran флуоресцентно помечены Техас Красный (dextran-TR) (Рисунок 2A-B). Dextran маркировки наблюдалась как…

Discussion

Этот протокол описывает, как выполнять эксперименты поглощения в мурин органа Корти explants с 3 kDa dextran Texas Red. Цель этого метода состоит в том, чтобы проверить, были ли молекулы больше, чем другие ранее протестированные, также способными специально маркировать слуховые волосковые клетки и п?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Винсента Шрама (Vincent Schram) из nicHD микроскопии и ядра изображений за помощь в приобретении конфокальных изображений, а Tsg-Hui Chang за неоценимую помощь в управлении колониями и по уходу за мышами. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы NINDS, NIH, Bethesda, MD, к K.J.S. A.B. была поддержана Программа интрамуральных исследований NINDS, NIH, и Роберт Wenthold Postdoctoral стипендию от программы интрамуральных исследований NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetica. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Tags

Keywords: Dextran LabelingLive Hair CellsMechanotransduction ChannelsCochlear DissectionFluorescent Dextran
check_url/it/60769?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image