JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولًا لاقتران مونومر البروتين بواسطة الإنزيمات التي تشكل بروتين البوليمر مع تسلسل يتم التحكم فيه وشل حركته على السطح لإجراء دراسات مطياف قوة أحادية الجزيء.

Abstract

وقد تم تطوير تقنيات الشبهة الكيميائية والبيولوجية بسرعة في السنوات الأخيرة وتسمح ببناء البوليمرات البروتينية. ومع ذلك ، فإن عملية بلمرة البروتين التي تسيطر عليها هي دائما تحديا. هنا ، قمنا بتطوير منهجية أنزيمية لبناء البروتين المبلمر خطوة بخطوة في تسلسل يتم التحكم فيه بعقلانية. في هذه الطريقة، C-terminus من مونومر البروتين هو NGL لاقتران البروتين باستخدام OaAEP1(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases)1) في حين أن N-terminus كان TEV قابل للفك (فيروس التبغ حفر) موقع الانقسام بالإضافة إلى L (ENLYFQ/GL) لحماية N-المحطة الطرفية المؤقتة. وبالتالي، كان OaAEP1 قادرة على إضافة مونومر بروتين واحد فقط في وقت واحد، ومن ثم البروتياز TEVمتشبثة ن-تالتيموس بين س وG لفضح NH 2-Gly-Leu. ثم الوحدة جاهزة لربط OaAEP1 المقبل. يتم فحص البروتين متعدد البروتين المهندس من خلال مجال البروتين الفردي المتكشف باستخدام المجهر الذري القائم على النسخة الطيفية أحادية الجزيء (AFM-SMFS). لذلك ، توفر هذه الدراسة استراتيجية مفيدة لهندسة البروتين المتعدد والتجميد.

Introduction

بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية ، والبروتينات الطبيعية متعددة المجالات لديها بنية موحدة مع عدد وتسيطر عليها بشكل جيد ونوع من النطاقات الفرعية1. هذه الميزة عادة ما يؤدي إلى تحسين الوظيفة البيولوجية والاستقرار2،3. وقد تم تطوير العديد من النهج، مثل السيستين المستندة إلى اقتران السندات ثنائي كبريتيد وتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، لبناء مثل هذا البروتين المبلمرة مع مجالات متعددة4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن الطريقة الأولى تؤدي دائمًا إلى تسلسل عشوائي وغير منضبط ، والأخيرة تؤدي إلى مشاكل أخرى ، بما في ذلك صعوبة التعبير المفرط للبروتينات السامة والكبيرة الحجم وتنقية البروتين المعقد مع العامل المساعد والإنزيمات الحساسة الأخرى.

لمواجهة هذا التحدي، ونحن تطوير طريقة الأنزيمية التي تترافق مونومر البروتين معا للبوليمر / البروتين المتعدد بطريقة تدريجية باستخدام بروتين ليغاز OaAEP1 جنبا إلى جنب مع TEV البروتياز8،9. OaAEP1 هو endopeptidase صارمة وفعالة. يمكن ربط بروتينين covalently كما Asn-Gly-Leu تسلسل (NGL) من خلال اثنين من التالتيني من قبل OaAEP1 في أقل من 30 دقيقة إذا كان N-terminus هو بقايا جلي ليو (GL) والآخر منها C-terminus هو مخلفات NGL10. ومع ذلك ، فإن استخدام OaAEP1 فقط لربط مونومر البروتين يؤدي إلى بروتين البوليمر مع تسلسل غير المنضبط مثل طريقة الاقتران القائمة على السيستين. لذلك ، نقوم بتصميم N-terminus لوحدة البروتين مع موقع بروتياز TEV قابل للإزالة بالإضافة إلى بقايا الليسين كـ ENLYFQ/G-L-POI. قبل انشقاق TEV، لن تشارك محطة N في ربط OaAEP1. ومن ثم يتم كشف بقايا GL في N-terminus ، والتي تتوافق مع ربط OaAEP1 ، بعد انشقاق TEV. وهكذا، حققنا طريقة التركيب الحيوي الأنزيمي متتابعة من البروتين المتعدد مع تسلسل تسيطر عليها بشكل جيد نسبيا.

هنا ، يمكن استخدام طريقة التوليف الأنزيمية خطوة بخطوة في إعداد عينة البروتين ، بما في ذلك تسلسل تسيطر عليها وغير المنضبط ، وتجميد البروتين للدراسات جزيء واحد كذلك ، وخاصة بالنسبة للنظام المعقد مثل metalloprotein.

وعلاوة على ذلك، تسمح لنا تجارب SMFS المستندة إلى AFM بتأكيد بناء البوليمر البروتيني واستقراره على مستوى الجزيء الواحد. الفئاب الطيفي أحادية الجزيء، بما في ذلك AFM، ملاقط بصرية وملاقط مغناطيسي، هو أداة عامة في تكنولوجيا النانو للتلاعب بالجزيء الحيوي ميكانيكيا وقياس استقرارها11،12،13،14،15،16،17،18،19،20. وقد استخدمت على نطاق واسع AFM جزيء واحد في دراسة البروتين (الأمم المتحدة) قابلة للطي21،22،23،24،25، وقياس قوة مستقبلات ليغاند التفاعل26،27،28،29،30،31،32،33،34 ،34، 35، السندات الكيميائية غير العضوية20،36،37،38،39،40،41،42،43والمعادن ligand السندات في metalloprotein44،45،46،47،48،49، 50 . هنا، يتم استخدام AFM جزيء واحد للتحقق من تسلسل البروتين متعدد البروتين توليفها على أساس إشارة البروتين تتكشف المقابلة.

Protocol

1. إنتاج البروتين استنساخ الجينات شراء الجينات الترميز للبروتين الفائدة (POI): Ubiquitin، Rubredoxin (RD)51،وحدة السليلوز ملزمة (CBM)، dockerin-X المجال (XDoc) والتماسك من فلافيلولاينس Ruminococcus،التبغ حفر فيروس (TEV) البروتياز، الإيلاستين مثل البولي ببتيدات (ELPs). أداء تفاع…

Representative Results

لن تؤثر بقايا NGL التي تم إدخالها بين البروتينات المجاورة من قبل ربط OaAEP1 على استقرار مونومر البروتين في البوليمر حيث أن القوة المتكشفة (<Fu> ) ، وزيادة طول كفاف (< ΟLc> ) قابلة للمقارنة مع الدراسة السابقة(الشكل 1). تظهر نتيجة تنقية بروتين الروبيدوكسين في الش?…

Discussion

لقد وصفنا بروتوكولًا لعملية التركيب الحيوي الأنزيمي وشل حركة البروتين المتعدد البروتين وتحققنا من تصميم البروتين المتعدد بواسطة SMFS المستندة إلى AFM. توفر هذه المنهجية منهجًا جديدًا لبناء البروتين البوليمر في تسلسل مصمم ، والذي يكمل الأساليب السابقة لهندسة البروتين المتعدد البروتين والت…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21771103، 21977047)، مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (المنحة رقم BK20160639) وبرنامج شوانغتشوانغ في مقاطعة جيانغسو.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. i. J., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochimica. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O’Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Tags

OaAEP1Enzymatic SynthesisPolymerized ProteinSingle-molecule Force SpectroscopyProtein OligomerPolymerization DegreeProtein-based MaterialCysteinePotassium ChromateSulfuric AcidAPTESSulfo-SMCCGL-ELP-50 Cys-proteinCantilever Surface
check_url/it/60774?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image