توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري
Summary
نقدم بروتوكولًا لشل الجزيئات الكبيرة المفردة في الأجهزة الميكروفلويدية وتحديد التغيرات في التشكيلات تحت تدفق القص. هذا البروتوكول مفيد لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية والوظيفية للجزيئات الحيوية مثل البروتينات والحمض النووي في بيئة التدفق.
Abstract
وقد تميزت سلوك جزيء واحد تحت اضطراب الميكانيكية على نطاق واسع لفهم العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك ، فإن أساليب مثل المجهر للقوة الذرية لها دقة زمنية محدودة ، في حين أن نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET) يسمح فقط بالاستدلال على التشوهات. من ناحية أخرى ، يسمح المجهر المجهري الفلوري في الوقت الحقيقي في التصور الموقعي لجزيئات واحدة في ظروف التدفق المختلفة. يصف بروتوكولنا خطوات التقاط التغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية المفردة تحت بيئات تدفق القص المختلفة باستخدام المجهر الفلوري. يتم إنشاء تدفق القص داخل قنوات microfluidic ويسيطر عليها مضخة حقنة. كعروض للطريقة ، يتم تسمية عامل فون ويلبراند (VWF) والحمض النووي لامدا مع البيوتين والفلوروفور ثم يتم شل حركتها على سطح القناة. يتم رصد التشكيلات باستمرار تحت تدفق القص المتغير باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) والمجهر المجهري الفلوري المعتري. ديناميات تفكك عكسها من VWF مفيدة لفهم كيفية تنظيم وظيفتها في الدم البشري، في حين أن تشكيل الحمض النووي لامدا يقدم رؤى في الفيزياء الحيوية للجزيئات الكبيرة. ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدراسة سلوك البوليمرات، وخاصة البوليمرات الحيوية، في ظروف التدفق المختلفة والتحقيق في ريولوجيا السوائل المعقدة.
Introduction
وقد درست على نطاق واسع آليات كيفية استجابة الجزيئات الحيوية للمحفزات البيئية. في بيئة التدفق على وجه الخصوص ، تنظم قوى القص والطول المدى التغيرات التشكيلية وربما وظيفة الجزيئات الحيوية. ومن الأمثلة النموذجية على ذلك كشف الحمض النووي لامدا وفون ويلبراند (VWF) الناجم عن القص. وقد استخدمت الحمض النووي لامبدا كأداة لفهم ديناميات تشكيلية من سلاسل البوليمر الفردية ومرنة وrheology من حلول البوليمر1،2،3،4. VWF هو مستشعر التدفق الطبيعي الذي يجمع الصفائح الدموية في مواقع الجروح في الأوعية الدموية مع معدلات القص غير الطبيعية وأنماط التدفق. كشف VWF أمر ضروري في تفعيل ربط الصفائح الدموية إلى المجال A1 والكولاجين ملزمة للمجال A3. وبالإضافة إلى ذلك، عالية القص الناجمة عن المجال A2 تتكشف يسمح انشقاق VWF، الذي ينظم توزيع الوزن الجزيئي في الدورة الدموية5،6. وبالتالي ، فإن التصور المباشر لكيفية عمل هذه الجزيئات تحت التدفق يمكن أن يعزز إلى حد كبير فهمنا الأساسي للميكانيكا الحيوية ووظيفتها ، والتي بدورها يمكن أن تمكن التطبيقات التشخيصية والعلاجية الجديدة.
وتشمل المنهجيات النموذجية لتوصيف التشكيلات أحادية الجزيء ملاقط بصرية/مغناطيسية، والمجهر المجهري للقوة الذرية (AFM) ونقل الطاقة بالرنين الرنين أحادي الجزيء Förster (FRET)7. التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد هو أداة قوية للتحقيق في القوة والحركة المرتبطة بالتغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية. ومع ذلك ، فإنه يفتقر إلى القدرة على رسم خريطة التشكيلات الجزيئية الشاملة8. AFM قادرة على التصوير بدقة مكانية عالية ولكنها محدودة في القرار الزمني9،10. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الاتصال بين الطرف والعينة إلى إرباك الاستجابة الناجمة عن التدفق. طرق أخرى مثل FRET وتحليلات nanopore تحديد البروتين جزيء واحد للطي وتتكشف الدول على أساس الكشف عن المسافة داخل الجزيئية والأحجام المستثناة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لا تزال في مهدها ومحدودة في ملاحظتها المباشرة لتكوينات جزيء واحد11،12،13،14.
من ناحية أخرى ، فإن المراقبة المباشرة للجزيئات ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية تحت المجهر الفلوري قد حسنت فهمنا لديناميكيات الجزيء الواحد في العديد من العمليات البيولوجية15،16. على سبيل المثال، حققت فو وآخرون مؤخرا تصور المدة المتزامنة لـ VWF والربط مستقبلات الصفائح الدموية للمرة الأولى. في عملهم ، تم شل جزيئات VWF على سطح قناة ميكروفلويديك من خلال تفاعلات البيوتين – ستريبتفيفيفيالدين وتصويرها تحت الانعكاس الداخلي الكلي للفلورسينس (TIRF) المجهري في بيئات تدفق القص المختلفة17. تطبيق طريقة مماثلة كما فو، ونحن هنا تثبت أن التشكيلات من VWF والحمض النووي لامدا يمكن ملاحظتها مباشرة تحت كل من TIRF والمجهر الفلوري المعتري. كما هو موضح في الشكل 1، يتم استخدام الأجهزة الدقيقة لإنشاء والتحكم في تدفق القص ، ويتم شل الجزيئات الحيوية على سطح القناة. عند تطبيق معدلات القص المختلفة ، يتم تسجيل التشكيلات من نفس الجزيء لقياس الطول الإرشادي ، كما هو موضح في الشكل 1. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لاستكشاف سلوكيات البوليمر الأخرى في ظل بيئات التدفق المعقدة لكل من الدراسات الريولوجية والبيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على بيانات عالية الجودة من التغيرات التشكيلية جزيء واحد باستخدام المجهر الفلوري كما هو موضح في هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان لاحتضان جزيء لمقدار الوقت المناسب، والحد من تفاعلاتها غير محددة مع السطح وإنشاء إعدادات المجهر التي تقلل من التبييض الضوئي. ترتبط قدرة الجزيء على تغيير ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال منحة المؤسسة الوطنية للعلوم DMS-1463234، والمنح الوطنية للصحة HL082808 وAI133634، والتمويل الداخلي لجامعة ليهاي.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
Riferimenti
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
