使用荧光显微镜在剪切流下描述单分子构象变化
Summary
我们提出了一种在微流体器件中固定单个大分子和量化其在剪切流下其一致性变化的协议。该协议可用于描述流动环境中蛋白质和DNA等生物分子的生物力学和功能特性。
Abstract
机械扰动下的单分子行为被广泛描述为了解许多生物过程。然而，原子力显微镜等方法的时间分辨率有限，而Fürster共振能量转移（FRET）仅允许推断一致性。另一方面，荧光显微镜允许在各种流动条件下对单个分子进行实时原位可视化。我们的协议描述了使用荧光显微镜捕获不同剪切流环境中单生物分子的构象变化的步骤。剪切流在微流体通道内产生，由注射器泵控制。作为该方法的演示，冯·威尔布兰德因子（VWF）和lambda DNA被标记为生物素和荧光素，然后固定在通道表面。使用总内部反射 （TIRF） 和共聚焦荧光显微镜在可变剪切流下持续监测其一致性。VWF的可逆分解动力学有助于理解其功能在人类血液中的调节，而 lambda DNA 的构象提供了对大分子生物物理学的见解。该方案还可用于研究聚合物，特别是生物聚合物在不同流动条件下的行为，以及研究复杂流体的流变学。
Introduction
生物分子对环境刺激的反应机制得到了广泛的研究。特别是在流动环境中，剪切力和伸长力调节构象变化，并可能调节生物分子的功能。典型的例子包括剪切引起的羊羔DNA和冯·威勒布兰德因子（VWF）的分解。Lambda DNA已被用作一种工具，了解个体、柔性聚合物链的构象动力学和聚合物溶液1、2、3、4的流变学。VWF 是一种自然流动传感器，可聚合血管伤口部位的血小板，剪切速率和流动模式异常。VWF 的分解对于激活血小板与 A1 域的结合和胶原蛋白与 A3 域结合至关重要。此外，高剪切诱导A2域展开允许VWF的裂解，调节其分子量分布在循环5，6。因此，直接可视化这些分子在流动下如何运行，可以大大增强我们对它们的生物力学和功能的基本理解，进而支持新的诊断和治疗应用。
描述单分子一致性的典型方法包括光学/磁性钳子、原子力显微镜（AFM）和单分子Fürster共振能量转移（FRET）7。单分子力谱谱是研究与生物分子的构象变化相关的力和运动的有力工具。然而，它缺乏绘制整体分子一致性8的能力。AFM能够成像高空间分辨率，但时间分辨率9，10是有限的。此外，尖端和样品之间的接触可能会混淆由流量引起的响应。其他方法，如FRET和纳米孔分析，根据分子内距离和排除体积的检测，确定单分子蛋白折叠和展开状态。然而，这些方法还处于起步阶段，在直接观察单分子一致性11、12、13、14方面还很有限。
另一方面，在荧光显微镜下直接观察具有高时空分辨率的大分子，提高了我们对许多生物过程中单分子动力学的理解15，16。例如，Fu等人最近首次实现了VWF伸长和血小板受体结合的同步可视化。在其工作中，VWF分子通过生物素-链球素相互作用固定在微流体通道表面，并在不同剪切流环境中在总内部反射荧光（TIRF）显微镜下成像17。应用与Fu类似的方法，我们在这里证明，VWF和lambdaDNA的一致性可以在TIRF和共聚焦荧光显微镜下直接观察到。如图1所示，微流体装置用于创建和控制剪切流，生物分子固定在通道表面。应用不同的剪切速率后，记录同一分子的一致性以测量延伸长度，如图1所示。该方法可广泛应用于复杂流动环境下研究其他聚合物行为，用于流变学和生物学研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了使用该方法中所述的荧光显微镜获得单分子构象变化的高质量数据，在适当的时间内孵育分子，尽量减少其与表面的非特异性相互作用至关重要并建立显微镜设置，以减少光漂白。分子自由改变构象的能力与分子与表面之间形成的生物链球菌相互作用的数量有关。如前所述，这必须通过在适当的时间内孵育无流量的分子来控制。此外，如果盖玻片没有有效堵塞，蛋白质或DNA可能非特有结合到?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分得到了国家科学基金会赠款DMS-1463234、国家卫生研究院赠款HL082808和AI133634以及利哈伊大学内部资助的支持。
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
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