蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴
Summary
マイクロ流体デバイス内の単一の高分子を固定化し、せん断流下での立体構造の変化を定量化するプロトコルを提示する。このプロトコルは、流れ環境におけるタンパク質やDNAなどの生体分子の生体力学的および機能的特性を特徴付けするのに役立ちます。
Abstract
機械的摂動下における単一分子挙動は、多くの生物学的プロセスを理解することが広く特徴付けられている。しかし、原子間力顕微鏡法は時間分解能が限られているのに対し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は立体構造の推測しか認めることができない。一方、蛍光顕微鏡法は、様々な流れ条件下での単一分子のリアルタイム可視化を可能にする。我々のプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて異なる剪断流環境下で単一の生体分子の立体構造変化を捉えるステップを記述する。剪断流はマイクロ流体チャネルの内部に作成され、シリンジポンプによって制御される。この方法のデモンストレーションとして、フォン・ヴィルブランド因子(VWF)とラムダDNAをビオチンとフルオロフォアで標識し、チャネル表面に固定化する。それらの立体構造は、全内部反射(TIRF)および共焦点蛍光顕微鏡を用いて可変剪断流下で連続的にモニタリングされる。VWFの可逆的な解明ダイナミクスは、その機能がヒト血液中でどのように調節されているかを理解するのに役立ちますが、ラムダDNAの立体構造は高分子の生物物理学に関する洞察を提供します。プロトコルはまた、様々な流れの条件でポリマー、特に生体高分子の挙動を研究し、複雑な流体の流動を調査するために広く適用することができる。
Introduction
生体分子が環境刺激にどう反応するかのメカニズムが広く研究されている。特に流れ環境では、せん断と伸びの力が、立体構造の変化を調節し、生体分子の機能を制御する可能性があります。代表的な例としては、ラムダDNAおよびフォン・ヴィルブランド因子(VWF)の剪断誘発解明が挙げられる。ラムダDNAは、個々の、柔軟なポリマー鎖の構造ダイナミクスとポリマー溶液1、2、3、4の流動を理解するためのツールとして使用されている。VWFは異常な剪断速度および流れのパターンの血管の傷ついた場所で血小板を凝集する自然な流れセンサーである。VWFの解明は、A1ドメインへの血小板の結合とA3ドメインへのコラーゲン結合を活性化するために不可欠である。さらに、高剪断誘導A2ドメイン展開は、循環中の分子量分布を調節するVWFの切断を可能にする5、6。したがって、これらの分子が流動下でどのように振る舞うかを直接視覚化することで、バイオメカニクスと機能に関する基本的な理解が大幅に高まり、新しい診断および治療用途が可能になります。
単一分子の立体構造を特徴付ける一般的な方法論には、光/磁気ピンセット、原子間力顕微鏡(AFM)および単分子フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)7が含まれる。単一分子力分光法は生体分子の立体構造変化に伴う力と運動を調べる強力なツールです。しかし、それは全体的な分子構造8をマッピングする能力を欠いている。AFMは、高い空間分解能でイメージングが可能であるが、時間分解能9、10に制限されている。また、先端と試料との接触は、流れによって誘導される応答を混乱させる可能性がある。FRETやナノポア分析のような他の方法は、分子内距離と除外された体積の検出に基づいて、単一分子タンパク質の折りたたみおよび展開状態を決定します。しかし、これらの方法は、まだ初期段階にあり、単一分子立体構造11、12、13、14の直接観察において制限されている。
一方、蛍光顕微鏡下で高い時間的および空間的分解能を有する高い時間的および空間的な高分子を直接観察することは、多くの生物学的プロセスにおける単一分子ダイナミクスの理解を改善した15,16。例えば、Fuら最近、初めてVWF伸長と血小板受容体結合の同時可視化を達成した。その研究では、VWF分子をビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して微小流体チャネルの表面に固定化し、様々な剪断流環境で全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡下で画像化した17。Fuと同様の方法を用いて、ここでは、VWFとラムダDNAの立体構造をTIRFと共焦点蛍光顕微鏡の両方で直接観察できることを実証します。図1に示すように、マイクロ流体デバイスを使用してせん断流を作成および制御し、生体分子をチャネル表面に固定化します。せん断速度の変化を適用すると、同じ分子の立体構造が記録され、伸長長を測定し、図1にも示される。この方法は、レオロジー研究と生物学的研究の両方のために複雑な流れの環境下で他のポリマー挙動を探求するために広く適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法で説明したように蛍光顕微鏡を用いて単分子の立体構造変化の高品質なデータを得るためには、適切な時間のために分子をインキュベートし、表面との非特異的相互作用を最小限に抑えることが重要であるそして、フォトブリーチを減らす顕微鏡の設定を確立します。この分子が自由に立体構造を変化させる能力は、分子と表面の間に形成されるビオチン-ストレプトアビジン相互作…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団助成金DMS-1463234、国立衛生研究所助成金HL082808とAI133634、リーハイ大学の内部資金によって部分的にサポートされました。
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
Riferimenti
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