Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza
Summary
Presentiamo un protocollo per l’immobilizzazione di singole macromolecole in dispositivi microfluidici e la quantificazione dei cambiamenti nelle loro conformazioni sotto il flusso di taglio. Questo protocollo è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche e funzionali di biomolecole come proteine e DNA in un ambiente di flusso.
Abstract
Il comportamento di una singola molecola in perturbazione meccanica è stato ampiamente caratterizzato per comprendere molti processi biologici. Tuttavia, metodi come la microscopia a forza atomica hanno una risoluzione temporale limitata, mentre il trasferimento di energia a risonanza del Fàrster (FRET) consente solo di dedurre le conformazioni. La microscopia a fluorescenza, d’altra parte, consente la visualizzazione in tempo reale in situ di singole molecole in varie condizioni di flusso. Il nostro protocollo descrive i passaggi per catturare i cambiamenti conformazionali di singole biomolecole in diversi ambienti di flusso di taglio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il flusso di taglio viene creato all’interno di canali microfluidici e controllato da una pompa di siringa. Come dimostrazioni del metodo, il fattore von Willebrand (VWF) e il DNA lambda sono etichettati con biotina e fluoroforo e quindi immobilizzati sulla superficie del canale. Le loro conformazioni sono continuamente monitorate sotto flusso di taglio variabile utilizzando la riflessione interna totale (TIRF) e la microscopia a fluorescenza confocale. Le dinamiche reversibili di svelamento di VWF sono utili per comprendere come la sua funzione è regolata nel sangue umano, mentre la conformazione del DNA lambda offre approfondimenti sulla biofisica delle macromolecole. Il protocollo può anche essere ampiamente applicato per studiare il comportamento dei polimeri, in particolare dei biopolimeri, in condizioni di flusso variabili e per studiare la reologia dei fluidi complessi.
Introduction
Sono stati ampiamente studiati i meccanismi di risposta alle biomolecole agli stimoli ambientali. In un ambiente di flusso in particolare, le forze di taglio e di allungamento regolano i cambiamenti conformazionali e potenzialmente la funzione delle biomolecole. Esempi tipici includono lo srotolamento indotto dalla cesoia del DNA lambda e il fattore von Willebrand (VWF). Il DNA Lambda è stato utilizzato come strumento per comprendere le dinamiche conformazionali delle singole catene polimeriche flessibili e la reologia delle soluzioni polimeriche1,2,3,4. VWF è un sensore di flusso naturale che aggrega le piastrine nei siti ferita dei vasi sanguigni con tassi di taglio anomali e modelli di flusso. Lo srotolamento di VWF è essenziale per attivare l’associazione delle piastrine al dominio A1 e il binding del collagene al dominio A3. Inoltre, l’elevata diffusione del dominio A2 indotto dalla cesoia consente la scissione di VWF, che regola la sua distribuzione del peso molecolare in circolazione5,6. Pertanto, la visualizzazione diretta di come queste molecole si comportano sotto il flusso può migliorare notevolmente la nostra comprensione fondamentale della loro biomeccanica e funzione, che a sua volta può consentire nuove applicazioni diagnostiche e terapeutiche.
Le metodologie tipiche per caratterizzare le conformazioni a singola molecola includono pinzette ottiche/magnetiche, microscopia a forza atomica (AFM) e trasferimento di energia a risonanza di rete (FRET)7a singola molecola. La spettroscopia a forza singola è un potente strumento per studiare la forza e il movimento associati ai cambiamenti conformazionali delle biomolecole. Tuttavia, manca la capacità di mappare le conformazioni molecolari complessive8. AFM è in grado di imaging ad alta risoluzione spaziale, ma è limitato nella risoluzione temporale9,10. Inoltre, il contatto tra la punta e il campione può confondere la risposta indotta dal flusso. Altri metodi come FRET e nanoporanalytics determinano gli stati di ripiegamento e dispiegamento delle proteine a singola molecola in base al rilevamento della distanza intramolecolare e dei volumi esclusi. Tuttavia, questi metodi sono ancora nella loro infanzia e limitati nella loro osservazione diretta di conformazioni a singola molecola11,12,13,14.
D’altra parte, osservare direttamente le macromolecole ad alta risoluzione temporale e spaziale nell’ambito della microscopia a fluorescenza ha migliorato la nostra comprensione della dinamica a singola molecola in molti processi biologici15,16. Ad esempio, Fu et al. ha recentemente raggiunto la visualizzazione simultanea dell’allungamento del VWF e del legame del recettore delle piastrine per la prima volta. Nel loro lavoro, le molecole VWF sono state immobilizzate sulla superficie di un canale microfluidico attraverso interazioni biotina-streptavidine e immagini sotto microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) in diversi ambienti di flusso di taglio17. Applicando un metodo simile a quello di Fu, qui dimostriamo che le conformazioni del VWF e del DNA lambda possono essere osservate direttamente sia nella microscopia TIRF che confocale a fluorescenza. Come illustrato nella Figura 1,i dispositivi microfluidici vengono utilizzati per creare e controllare il flusso di taglio e le biomolecole vengono immobilizzate sulla superficie del canale. Al momento dell’applicazione di tassi di taglio variabili, le conformazioni della stessa molecola vengono registrate per misurare la lunghezza dell’estensione, mostrata anche nella Figura 1. Il metodo potrebbe essere ampiamente applicato per esplorare altri comportamenti polimerici in ambienti di flusso complessi per studi reologici e biologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ottenere dati di alta qualità dei cambiamenti conformazionali a singola molecola utilizzando la microscopia a fluorescenza come descritto in questo metodo, è fondamentale incubare la molecola per la quantità di tempo appropriato, ridurre al minimo le sue interazioni non specifiche con la superficie e definire le impostazioni del microscopio che riducono il fotosbiancamento. La capacità della molecola di cambiare liberamente la conformazione è correlata al numero di interazioni biotina-streptavidina formate tra l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della National Science Foundation DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 e AI133634, e finanziamenti interni della Lehigh University.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
Riferimenti
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